Tema 1. Técnicas de estudio celular

Question 1

Mencione los postulados de la teoría celular.

Answer 1

1. Todo ser vivo está formado por una o más células.
2. La célula es la unidad anatómica y fisiológica de todos los seres vivos.
3. Toda célula procede de otra célula preexistente.
4. El material genético es heredado directamente entre generaciones.

Question 2

Indique ¿en qué año Robert Hooke observó células de corcho?

Answer 2

1655.

Question 3

Mencione los niveles de organización de la vida.

Answer 3

Molécula, Organela, Célula, Tejido, Órgano, Sistema o aparato, Organismo.

Question 4

Mencione los tamaños promedio de una célula vegetal, animal, procarionte y de una partícula viral.

Answer 4

Vegetal: 100 µm.
Animal: 10 µm.
Procarionte: 1 µm.
Virión: 100 nm.

Question 5

Mencione y describa la utilidad de las técnicas de estudio celular

Answer 5

• Microscopía
  Fácil y barata, solo nos permite conocer morfología.
• Genómica
• Proteómica
• Metabolómica
  Complejas y caras, nos permiten conocer información específica.

Question 5

Mencione el concepto de microscopía

Answer 5

Conjunto de técnicas que permiten ampliar imágenes impercibibles al ojo humano.

Question 6

Concepto de poder de resolución

Answer 6

Es la capacidad que tiene un sistema óptico de aislar dos puntos que se encuentran muy próximos entre sí.

Question 7

Describa la naturaleza de un microscopio óptico de campo claro

Answer 7

Aumenta células hasta 1000 veces, permite ver especímenes iluminados con luz clara. Tiene un poder de resolución de 0,2 µm. Requiere de luz brillante, un sistema de lentes y un espécimen para observación. Permite observar muestras con coloración. Existen de dos tipos, compuesto y de disección.
El compuesto estudia fragmentos pequeños y finos en dos dimensiones en mayor aumento; el de disección estudia especímenes en tres dimensiones con un menor aumento.

Question 8

Mencione la técnica de montaje en fresco para microscopía óptica de campo claro compuesto.

Answer 8

1. (Opcional) Tinción
2. Suspención acuosa
3. Montaje en portaobjetos.

Question 8

Características de un microscopio electrónico de transmisión

Answer 8

• Emplea lentes magnéticos que focalizan el haz de electrones.
• Muestra laminar al vacío en rejilla de cobre.
• Metales pesados producen contraste.
• Mxima resolución 2 nm.
• Imágenes bimensionales de la sección transversal de la muestra (transiluminación).

Question 8

Clasificación de las técnicas de estudio celular

Answer 8

• Estudio celular morfológico
• Estudio celular fisicoquímico

Question 9

Mencione las técnicas de estudio morfológico de la célula y su utilidad

Answer 9

Nos permiten conocer la estructura y tamaño celular.
- Microscopía óptica
- Microscopía electrónica

Question 10

Mencione las técnicas de estudio fisicoquímico celular y su utilidad en general

Answer 10

Se utilizan para conocer la composición y fisiología celular
- Citoquímica
- Centrifugación
- Cromatografía
- Electroforesis
- Cultivos in vitro

Question 11

Mencione los tipos de microscopía electrónica y su característica distintiva

Answer 11

Existen dos:
- De rastreo o barrido
- De transmisión

Usa electrones en lugar de fotones para formar imágenes de objetos diminutos

Question 12

Microscopio óptico de contraste de fase

Answer 12

Muestra fase sólida oscura, fase líquida clara. No requiere colorantes.

Question 13

Partes del microscopio óptico de campo claro compuesto

Answer 13

• Ocular (5x, 10x, 15x y 20x)
• Tubo
• Revolver
• Objetivos (10x, 20x, 40x, 100x)
• Platina
• Condensador
• Diafragma
• Tornillos macro y micrométricos
• Fuente de luz
• Pie
• Brazo

Question 14

Partes del microscopio óptico de campo claro de disección

Answer 14

• Oculares
• Dioptrías
• Perilla de enfoque
• Fuente superior
• Fuente inferior
• Pinzas
• Platina
• Cabezal
• Alimen

Question 15

Microscopio óptico de campo oscuro

Answer 15

• Modificación de un microscopio de campo claro.
• Solo permite el paso de haces de luz difractada.
• No requiere coloración.
• Permite estudiar el movimiento flagelar, ameboideo y bacteriano.

Question 16

Microscopio óptico de fluorescencia

Answer 16

Contiene dos filtros. El primero solo deja pasar la longitud de onda de la luz que excita al colorante de la muestra. La segunda solo deja pasar la luz emitida por el colorante de la muestra.
- Visualización directa de estructuras biomoleculares. Es utilizada para diagnósticos de enfermedades.

Question 17

Mencione el concepto de genómica.

Answer 17

Es el estudio de la estructura, funcion y herencia del conjunto entero de la información genética de un individuo. Se centra en vincular la información molecular compilada en el ADN con la función real de los genes y el efecto de la regulación en su expresión.

Question 18

Mencione el concepto de proteómica

Answer 18

Es el estudio a gran escala del proteoma, el conjunto de todas las proteínas producidas por un individuo. En particular, son estudiadas tanto su estructura como su función.

Question 19

Mencione el concepto de metabolómica

Answer 19

Es el estudio de los sustratos y los productos del metabolismo, influenciados por factores genéticos y ambientales.

Question 20

Microscopía electrónica de barrido

Answer 20

• Emplea un haz de electrones y bobinas magnéticas (lentes magnéticos) para enfocar el haz de electrones.
• Es necesario que la muestra se cubra con una fina capa de metales pesados que repelen los electrones, haciendo visible la muestra.
• La muestra es barrida por el haz de electrones (primarios), cuya imagen (electrones secundarios) es reflejada con dirección a un foco detector con bobinas direccionales. Los átomos del espécimen producen rayos X que también son detectados.
• Produce imágenes tridimensionales con una resolución de hasta 3 nm reflejando la superficie del espécimen sólido por epi-iluminación.

Question 21

Características de la fijación de muestras

Answer 21

• Puede ser física (por medio de calor) o química (utilizando reactivos como etanol, formaldehído, ácido acético u otros), con sustancias que penetran en la célula sin alterar (mucho) su morfología.
• Evita la destrucción enzimática de células y la proliferación bacteriana, pero puede crear artefactos.

Question 22

Defina qué es un artefacto en microscopía óptica compuesta.

Answer 22

Un artefacto se define como cualquier alteración indeseada introducida en una muestra de tejido debido a las técnicas de procesamiento que se realizan para su observación.

Question 23

Describa las características de la tinción por hematoxilina-eosina

Answer 23

Es uno de los principales métodos de tinción en histología, y también es considerada como una prueba gold-standard en diagnóstico celular. La hematoxilina, de naturaleza básica, tiñe heterocromatina, nucleolos, ARN ribosomal, matriz extracelular (y otros componentes celulares acídicos) de un color azul violáceo y la eosina (de naturaleza ácida) tiñe filamentos citoplasmáticos, componentes membranosos intracelulares fibras extracelulares (y otras estructuras celulares básicas) de color rosado.
Particularmente se llaman basófilos a los componentes celulares acídicos teñidos de azul de hematoxilina. Análogamente son acidófilos los componentes rosados básicos teñidos con eosina.

Question 24

Describa las técnicas de preparación de muestras histológicas para microscopía óptica compuesta (microtécnia).

Answer 24

Particularmente en histología es común la utilización de técnicas de procesamiento que implican el segmentado de la muestra utilizando un microtomo. Dichas muestras deben estar fijadas en polímeros acrílicos o parafínicos para permitir el correcto corte de las secciones histológicas.
Están compuestos por el desparafinado, la hidratación, la tinción, la deshidratación y el montado de la muestra.

Question 25

Describa la naturaleza de las técnicas de tinción.

Answer 25

Son procedimientos que generan contrastes en los elementos celulares o histológicos, implican la utilización de uno o varios colorantes de modo simultáneo o sucesivo.
Existen dos tipos de tinción: simple y diferencial.

Question 26

Características de la tinción simple

Answer 26

La tinción simple proporciona únicamente información sobre la forma, tamaño y agrupación de los microorganismos, todos los microorganismos toman el mismo color. Es una tinción fácil y rápida. Algunos ejemplos de colorantes son el azul de metileno, el cristal violeta y la fucsina.

Question 27

Características de la tinción diferencial

Answer 27

Coloración que pone en manifiesto la diferencia entre células microbianas o entre subestructuras de la misma célula. Comprenden el empleo de más de un colorante, mordiente y/o decolorantes específicos. Algunos ejemplos son la tinción de gram, la tinción de endoesporas, etc.

Question 28

Describa el procedimiento de preparación de muestras para microscopía electrónica de transmisión.

Answer 28

• Se realiza en primer lugar una extracción de la muestra y su fijación en un recipiente.
• Se realiza una deshidratación e inclusión en resinas para poder realizar cortes finos.
• Mediante el ultramicrótomo, es posible generar cortes muy delgados de sección transversal.
• Los cortes se exponen a sales de metales pesados como el uranio y el plomo.
• Finalmente, las muestras se incluyen en una rejilla soporte que se introduce en el microscopio electrónico para reflejar imágenes de sección transversal de la muestra.

Question 29

Mencione las características de los métodos citoquímicos de estudio celular.

Answer 29

Permiten la identificación y localización de compuestos y/o radicales químicos en las células. Esto se logra provocando reacciones químicas entre los colorantes empleados y las sustancias celulares de análisis.
El producto final de dichas reacciones son compuestos insolubles, coloreados o electrodensos que pueden ser visualizados en el microscopio óptico o el microscopio electrónico.

Question 30

Mencione y describa los métodos citoquímicos de estudio de macromoléculas proteínicas.

Answer 30

Su identificación se basa en métodos de detección de aminoácidos. Existen varios tipos:
- La reacción de sakaguchi, que detecta la arginina de las proteínas básicas como las histonas y protaminas.
- La reacción de millón, en la que un reactivo nitroso-mercúrico reacciona con los grupos de tirosina dando un precipitado de color rojo.

Question 31

Mencione y describa los métodos citoquímicos de detección de macromoléculas polisacárídicas.

Answer 31

El método más utilizado es la reacción de PAS (ácido periódico-schiff), donde el ácido oxida a los azúcares en posición 1 y 2 y deja que los aldehídos libres producidos reaccionen con el reactivo de schiff produciendo un compuesto insoluble y coloreado. De este modo se demuestra la presencia de glucógeno en el hígado y los músculos, los depósitos intracelulares de glucógeno en enfermedades congénitas, la presencia de glucosaminoglicano o mucopolisacárido, que forma parte de los proteoglicanos, y la presencia de glucoproteínas, todos ellos de color rosado magenta.

Question 32

Mencione y describa los métodos citoquímicos de detección de macromoléculas lipídicas.

Answer 32

• Se emplean colorantes apolares solubles en lípidos como SUDAN III (coloración roja) y tetróxido de osmio (SUDAN IV, de coloración negra grisácea).
• Los tejidos se sumergen en soluciones alcohólicas saturadas de colorantes muy liposolubles y débilmente solubles en alcohol.
• Se tiñen especialmente las células adiposas y las cubiertas de fibras nerviosas.
• Se usan para el diagnóstico de enfermedades metabólicas producidos en depósitos lipídicos intracelulares.

Question 33

Mencione y describa los métodos citoquímicos de detección de macromoléculas de ADN.

Answer 33

Se realiza por medio de la reacción de Feulgen, donde es utilizado el reactivo de schiff (fucsina básica con anhídrido sulfuroso) para demostrar la presencia de grupos aldehído.
Consiste en la hidrólisis del ADN con ácido clorhídrico para extraer las bases púricas y dejar en libertad los grupos aldehídicos de los azúcares.
Esta reacción presenta proporcionalidad entre la intensidad del color producido y el contenido en ADN del núcleo.

Question 34

Explique la naturaleza del por qué se utilizan métodos físicos de separación de células (a.k.a. centrifugación)

Answer 34

Los componentes de los seres vivos de manera abrumadoramente frecuente se encuentran formando mezclas muy complejas. Por este motivo, utilizamos métodos físicos de separación celular para:
- Estudiar tejidos con distintos tipos celulares (sangre y todo el resto de tejidos).
- Identificar células con diferente funcionalidad u actividad biológica.
- Analizar subpoblaciones celulares con diferentes marcadores moleculares (comparar diferencias en poblaciones celulares a nivel genómico)
- Comprender el papel bioquímico de cada orgánulo de la célula.

Question 35

Explique la naturaleza y el mecanismo de la separación celular por centrifugación.

Answer 35

La centrifugación es una técnica de separación de mezclas (particularmente de sólidos y líquidos) en función a su densidad por medio de la exposición a una fuerza centrípeta provocada por un movimiento circular a altas velocidades.
La centrifugación funciona empujando los componentes más densos de la célula al punto más alejado del eje de rotación, y dejando los menos densos en el punto más cercano (nótese el hecho de que la definición de densidad es masa/volumen).

Question 36

Explique el método de separación (fraccionamiento?) de componentes subcelulares

Answer 36

Se realiza en dos etapas:
1. El tejido es homogeneizado en una solución tampón isotónica utilizando una variedad de mecanismos (molienda, picada, trituración, cambios de presión, choque osmótico, congelación y descongelación; u homogeneización por ultrasonidos).
2. La solución obtenida es centrifugada y por ende los componentes intracelulares se encuentran distribuidos en gradiente de densidad.

Question 37

Describa algunas características cualitativas de las microcentrífugas.

Answer 37

• Son las centrífugas utilizadas para la separación de muestras con volúmenes más pequeños (de entre 0,5 a 2000 uL).
• Funcionan a una velocidad de entre 12K a 13K revoluciones por minuto.
• Se utilizan para la separación molecular de orgánulos celulares como los núcleos y el ADN, y para la extracción de fenol (wtf).
• Existen microcentrífugas con controles de temperatura para el centrifugado de muestras sensibles a la temperatura (a.k.a. proteinas)

Question 38

Mencione algunos de los tipos de centrífugas y sus características.

Answer 38

• Centrífuga de alta velocidad
  Tiene velocidades máximas de entre 18K y 25K revoluciones por minuto. Son refrigeradas y contienen un sistema de vacío (wtf pq?). Son útiles para la separación de fracciones celulares.
• Ultracentrífugas
  Comprenden velocidades mayores a 50K rpm. También presentan sistemas de refrigeración y de alto vacío. Existen de dos tipos: Las analíticas permiten la obtención de datos precisos de propiedades de sedimentación (a.k.a. S de svedbergs o PM’s). Las preparativas permiten aislar partículas, células o moléculas para su análisis o utilización posterior.

Question 39

Mencione algunos de los tipos de centrifugación y describa sus características.

Answer 39

• Centrifugación diferencial
  Aprovecha la diferencia de velocidad de sedimentación de las distintas moléculas de una mezcla. Así, las partículas de densidades similares se sedimentan juntas en gradiente de densidad. Usualmente se usa para separar componentes de una mezcla y constituye el paso preparatorio para procesos de separación de moléculas.
• Centrifugación isopícnica
  Añade medios de distinta densidad (en gradiente homogéneo) a partículas que comparten el mismo coeficiente de sedimentación para separarlas por medio de la fuerza centrípeta. Así las moléculas se encuentran emparejadas con moléculas de sustrato de diferencia de densidad análoga.
• Centrifugación zonal
  Es análoga a la centrifugación isopícnica pues se utilizan medios de distinta densidad pero no en gradiente homogéneo, sino en gradiente inmiscible. El homogeneizado se sitúa por encima del medio y es centrifugado. De manera análoga a la centrifugación isopícnica, las moléculas se ordenarán en función a su densidad, pero ahora se encontrarán en zonas inmiscibles de medio acuoso.

Question 40

Describa la naturaleza de funcionamiento del método de cromatografía.

Answer 40

La cromatografía es un método físico de separación de moléculas para la caracterización de mezclas complejas, permitiendo identificar y determinar las cantidades de sus componentes.
Se basa en la diferencia de velocidad de arrastre, carga, hidrofobicidad, tamaño o alguna otra propiedad, por la ascención de una porción de agua por tensión superficial en la superficie de un papel (aún que también puede ser realizada en gases u otros líquidos lol).

Question 41

Explique la naturaleza del método de electroforesis

Answer 41

Consiste en la migración proporcional de moléculas, a través de un gel u otro tipo de polímero poroso, en función de su peso molecular, densidad y carga.
Implica la utilización de una fuente de energía, el medio de migración (sustrato), un líquido conductor (buffer) y obviamente, la muestra.
Existen varios tipos, pudiendo hacerse vertical u horizontalmente.
Algunos sustratos para la electroforesis pueden ser papel, acetato-celulosa, agarosa, geles de almidón o poliacrilamida.
Cabe destacar que las muestras que han sido separadas por electroforesis pueden ser aisladas por medio de kits de separación de sustrato (y eso es otra vaina interesante)

Question 42

Explique la naturaleza del método de cultivo celular y sus características.

Answer 42

Su propósito es aislar células y obtener, a partir de ellas, poblaciones homogéneas que luego pueden ser analizadas e incluso multiplicarse in vitro (en laboratorio).
El cultivo celular ofrece ventajas como:
- (en investigación) Comprensión de la fisiología celular de células específicas, como así realizar estudios de toxicología y virología.
- (en ingeniería de tejidos) la formación de tejidos para transplantes o injertos.
- (en producción de biomasa) la formación de anticuerpos monoclonales, hormonas, enzimas, vacunas, y/o viriones desactivados.
- (en citogenética) estudios genómicos y todas esas vesches de genómica.
- (en transgénicos) permiten obtener organismos genéticamente modificados.