TEMA 1 - Replicación y Reparación en Procariotas Flashcards
¿Cuáles son las características generales de la replicación?
Está sometida a un control riguroso (tiene que ir acoplada a la división celular).
Es semiconservativa
Es semidiscontinua
¿Qué quiere decir que la replicación sea semiconservativa?
Cada molécula hija de ADN está formada por una cadena parental y otra cadena de nueva síntesis.
¿Qué quiere decir que la replicación sea semidiscontinua?
Al abrirse la horquilla de replicación, en la leading strand(3’-5’) se puede sintetizar una cadena 5’-3’.
Sin embargo en la lagging strand(5’-3’), como las DNA polimerasas solo sintetizan en sentido 5’-3’, la síntesis se da en fragmentos de Okazaki, que después son unidos por una ligasa.
¿Cómo demostraron Meselson y Stahl que la replicación era semiconservativa?
- Incubaron E. coli en atmósfera de Nitrógeno pesado (N15) durante varias generaciones. De esta manera, todo el DNA estaría marcado con N15. Se centrifugó con CsCl y se obtuvo una sola banda, correspondiente a N15.
- Después de una generación, se centrifugó otra vez y se obtuvo una banda intermedia (descartamos modelo conservativo). La banda intermedia corresponde a una hebra pesada y otra ligera.
- Después de dos generaciones se repitió el proceso y se obtuvo la misma banda intermedia y otra banda correspondiente a N14 (ligero). (descartamos modelo dispersivo). De la hebra pesada y la ligera, se sintetizaron dos hebras ligeras, por lo que tenemos HL (intermedia) y LL(ligera).
¿En el experimento de Meselson y Stahl, qué propiedad de la replicación era importante que tuviesen las bacterias?
Que llevasen a cabo una replicación lenta y sincronizada ya que hay bacterias que cuando ya está en marcha una replicación, comienzan otra para dividirse más rápido. Esto último haría muy dificil distinguir generación a generación y replicación a replicación.
¿Cómo demostró Okazaki que la replicación semidiscontinua se daba a través de la síntesis de fragmentos de Okazaki?
¿Cómo se da a cabo la reacción catalizada por las DNA polimerasas en términos generales?
¿Qué necesita la DNA polimerasa para sintetizar DNA?
- Un extremo 3’-OH proporcionado por el primer.
- Una hebra molde (template).
- dNTPs
- Iones divalentes
¿Cómo introduce la polimerasa la base correcta en la secuencia?
La polimerasa no entiende de bases, solo entiende de una distancia uniforme entre los pares de bases (AT=11,1A GC=10,8A). Combinaciones erróneas de bases no llegarían a estar a esta distancia y el OH-3’ no podría atacar al fosfato en alfa.
A
Fingers
B
Thumb
C
Palm
A
Fingers
B
Thumb
C
Palm
¿En qué parte de la polimerasa se encuentra el centro catalítico?
Palm
¿Cuál es la función de los iones divalentes (Mg2+) en la reacción de la DNA polimerasa?
Los iones divalentes estan pegados a residuos de ácido aspártico (-vo) del centro catalítico de la polimerasa. Se encargan de coordinar los fosfatos y 3’-OH para estabilizarlos y colocarlos de forma que se produzca la reacción.
¿Qué actividades suelen tener las polimerasas?
Polimerasa 5’-3’ (síntesis de DNA)
Exonucleasa 3’-5’ (degradación del DNA o proofreading)
La tasa de mutación de la actividad polimerasa 5’-3’ es de 10^-5. ¿Cómo se consigue bajar la mutación de la replicación del genoma a 10^-10?
La actividad 3’-5’ exonucleasa disminuye la tasa a 10^-7.
Los sistemas de reparación del ADN lo bajan a 10^-10.
¿Dónde se suele encontrar la actividad 3’-5’ exonucleasa?
En el mismo polipéptido que la 5’-3’ polimerasa.
¿Cuándo se da la actividad 3’-5’ exonucleasa?
Cuando hay pares de bases incorrectos = distancia no es la correcta = mayor afinidad por 3’-5’ exonucleasa.
¿Cuáles son las actividades de la DNA polimerasa I?
Polimerasa 5’-3’
Exonucleasa 3’-5’
Exonucleasa 5’-3’ (eliminación de primers)
¿Cómo lleva a cabo su actividad la DNA polimerasa I?
¿Qué es el fragmento Klenow?
Un fragmento de la DNA polimerasa I que se obtuvo tras tratamiento proteolítico, de manera que se eliminaba la actividad exonucleasa 5’-3’. (útil en investigación cuando se quiere replicar DNA).
A
DNA polimerasa I
B
DNA polimerasa II
C
DNA polimerasa III
¿Qué es la procesividad de una enzima?
El número de eventos catalíticos (nucleótidos) que una enzima cataliza antes de caerse del sustrato (ADN en este caso).
¿Por qué es importante que la DNA pol replicativa tenga una alta procesividad?
La unión de la DNA polimerasa al DNA es un proceso lento (relativamente) por lo que si se tuviera que estar uniendo con mucha frecuencia, el proceso de replicación se enlentecería mucho.
¿Por qué existen muchas copias (400/célula) de la DNA pol I?
Tiene una velocidad de polimerización lenta y una baja procesividad, por lo que es necesario que haya muchas copias.
¿Cuál es la función de la subunidad beta de las polimerasas?
Aumentar la procesividad (pinza deslizante).
¿En qué se basa la teoría del replicón?
En la iniciación de la replicación se requieren dos componentes:
- Replicador (origen de replicación).
- Proteína iniciadora (reconoce el origen, lo abre y recluta la maquinaria de replicación).
Replicón: unidad de replicación del DNA con origen, terminación y cualquier otro elemnto necesario.
¿Cómo se consiguió aislar el origen de replicación oriC en E. coli?
¿Cómo se descubrió que la DNA pol III era la replicativa?
A
DUE (DNA unwinding element). 3 elementos de 13pb ricos en AT (solo dos puentes de H, se separa más fácilmente).
B
Cajas DnaA. Sitios de union para la proteína iniciadora DnaA 4 sitios de 9pb.
¿Qué es una secuencia consenso?
¿Cómo es la replicación en E. coli?
Bidireccional y con un único origen de replicación.
¿Cuál es la función de la DnaA en la replicación?
Proteína iniciadora. Se combina con ATP y se une furtemente a la cadena, provocando una tensión helicoidal negativa, que provoca que la doble hebra se abra en las cadenas DUE.
¿Cuál es la función de la DnaB y DnaC en la replicación?
DnaB es la helicasa(desenrolla la doble hélice). Se une con 6DnaC(cargador) y 6ATP. Cuando se carga una helicasa por cada horquilla de replicación, la DnaC se disocia.
¿Cuál es la función de la DnaG en la replicación?
Es la primasa. Se une a la helicasa (DnaB) y cataliza la síntesis del primer (ARN) ‘de novo’ ya que no necesita extremo 3-OH’.
¿Cuál es la función de las SSB en la replicación?
Single strand DNA binding protein. Se une al DNA de cadena sencilla que va dejando la helicasa y lo protege. También impide la formación de estructuras secundarias.
¿Cómo se activa/desactiva la proteína iniciadora DnaA?
DnaA tiene actividad ATPasa.
Forma activa: DnaA-ATP
Forma inactiva: DnaA-ADP.
La DnaA se inactiva al iniciar la repicación, para que no se inicie varias veces.
¿Por qué se necesita a la proteína iniciadora (DnaA), si ya tenemos la helicasa (DnaB)?
La helicasa no puede abrir un dsDNA, solo puede unirse y desenrollarlo cuando este ya está abierto (por la DnaA).
¿Tiene la DnaB (helicasa) actividad ATPasa?
¿Qué es el primosoma?
El conjunto de la helicasa (DnaB) y la primasa (DnaG) que se encarga de desenrollar el DNA y sintetizar el primer para empezar la replicación.
¿Qué es la DNA polymerase III holoenzyme?
El complejo que une a las dos polimerasas (una en cada hebra), el cargador de la pinza deslizante y la pinza deslizante.
¿Qué subunidad de la DNA Pol III holoenzyme es responsable de la actividad polimerasa 5’-3’?
Subunidad alfa de la DNA polimerasa III
¿Qué subunidad de la DNA Pol III holoenzyme es responsable de la actividad exonucleasa 3’-5’?
Subunidad epsilon de la DNA polimerasa III
¿Qué subunidad de la DNA Pol III holoenzyme es responsable de la actividad de pinza deslizante?
Subunidad beta
¿Qué subunidad de la DNA Pol III holoenzyme es responsable de la actividad de cargador de pinza?
Complejo gamma
¿Qué subunidad de la DNA Pol III holoenzyme es responsable de la dimerización?
Subunidad tao
¿Qué es llamativo sobre la evolución de la pinza deslizante en distintos organismos?
Subuidad beta en E. coli y PCNA en eucariotas tienen un origen que no es común. Dos proteínas han evolucionado a tener la misma estructura y mismas propiedades, a pesar de tener secuencias distintas.
¿Cómo funciona el cargador de pinza deslizante?
Se une a la pinza deslizante y la abre, la coloca alrededor del DNA y después mediante hidrólisis de ATP, consigue cerrar la pinza deslizante alrededor del DNA. El cargador se separa de la pinza deslizante una vez completado el proceso.
A
Complejo gamma (cargador de la pinza deslizante).
B
Proteína tao
C
Leading strand DNA polymerase
D
Helicasa
G
Pinza deslizante (subunidad beta)
F
Lagging strand DNA polymerase
E
SSB unido a ssDNA
¿Qué va a ocurrir cuando la DNA pol III del lagging strand termine de sintetizar el fragmento de okazaki que está sintetizando actualmente?
La primasa completa el primerque estaba sintetizando y deja un extremo 3’-OH libre.
La polimerasa se disocia de la pinza deslizante.
El cargador va a cargar una nueva pinza deslizante, donde se va a unir la polimerasa y va a sintetizar el siguiente fragmento de Okazaki.
¿Cómo termina la replicación del ADN procariota?
Existen los sitios Ter, que son secuencias a las que se va a unir la proteína Tus (contrahelicasa) que va a terminar la replicación. Los sitios Ter y las proteínas Tus son específicos para un sentido.
¿En la hebra lagging, cómo se eliminan los primers(ARN) y se unen los fragmentos de Okazaki?
- DNA polimerasa I tiene actividad 3’-5’ exonucleasa, 5’-3’ polimerasa y actividad 5’-3’ exonucleasa. Son estas dos últimas las que usa para degradar el primer a la vez que sintetiza DNA para reemplazarlo.
- Nick translation: al principio habi1a un nick (hueco) entre un fragmento de okazaki y el siguiente primer. Ahora ese nick ha sido trasladado al final del DNA que ha sustituido el primer.
- La ligasa se encarga de sellar el nick (une los fragmentos).
¿Qué función realiza la girasa (topoisomerasa II)?
El avance de la horquilla de replicación genera tensión, que a su vez genera supervueltas positivas del ADN, que la helicasa no puede separar.
La topoisomerasa corta el ADN, resuelve el enrollamiento +vo y vuelve a unirlo.
Normalmente se generan supervueltas negativas, pero no suponen un problema.
¿Qué diferencia existe entre la toposiomerasa I y la topoisomerasa II?
La topoisomerasa I corta solo una hebra (y no usa ATP) mientras que la topoisomerasa II corta las dos hebras (y usa ATP).
¿Cuál es la función de la topoisomerasa IV?
Al coincidir dos horquillas de replicación en sentidos contrarios, se pueden generar concatenados (las dos copias del ADN envueltas entre si).
La DNA toposiomerasa IV se encarga de separar las dos copias.
¿Qué función tienen las secuencias GATC en oriC en el control de la replicación?
La dam metilasa es ua enzima que metila la A en GATC.
Cuando se sintetiza una nueva hebra, el DNA permanece hemimetilado (13 mins mas o menos).
La proteína seqA se une a el DNA hemimetilado, evitando que se una la DnaA, evitando que se vuelva a empezar la replicación.
¿Cómo puede ser que haya distintos tiempos de generación en una bacteria, si el tiempo de replicación del genoma y el tiempo de división celular son constantes?
