TEHNIKE PROČIŠĆIVANJA PROTEINA Flashcards
ZAŠTO PROČIŠĆUJEMO PROTEINE?
ZNANSTVENA PRIMJENA
-određivanje slijeda aminokiselina u proteinu
-određivanje strukture proteina
-kristalografija (3D struktura protreina)
-proizvodnja monoklinskih i poliklinskih protutijela
TERAPIJSKA PRIMJENA
-proizvodnja regulatornih čimbenika( hormoni, citokini, limfokini i sl.)
-proizvodnja krvih produkata: krvni faktori, interferoni, eritropoetin, faktor zgrušavanja 8 itd.
-proizvodnja cijepiva
-proizvodnja monoklonskih protutijela i seruma
KOJI SU OSNOVNI ČIMBENICI KOJE TREBA PRATITI KADA PRIČAMO O PROČIŠĆIVANJU PROTEINA?
- STUPANJ ČISTOĆE
- ISKORIŠTENJE
- TROŠAK (novac)
KKAO IZRAŽAVAMO KOLIČINU PROTEINA
-u mjernoj jedinici KATALu (mol/s)
-katal izražava kolika je količina proteina/enzima potrebna da 1 mol supstrata prevede u produkt za 1 sec
-UI (univerzalna jedinica)= mikromol/min
-osnovna mjera tijekom pročišćavanja proteina je katal/g ili IU/mg
OPIŠI POSTUPAK PROČIŠĆIVANJA
- utvrđujemo kolika je potreba za čistoćom proteina
2.odabir tehnike pročišćivanja na temelju osobina proteina i nečistoća - uklanjanje nečistoća
- primjena tehnike uz minimalni broj adicija tvari koje bi mogle smanjiti enzimatsku aktivnost
- minimalizirati rad s proteinom radi gubitka enzimatske aktivnosti
- razrada rezulata
KOJI SU SVE IZVORI BIOLOŠKOG MATERIJALA
-biljno tkivo
-životinjsko tkivo
-humano tkivo
-rekombinantna staničja6
OPIŠITE HOMOGENIZACIJU TKIVA
-to je prevođenje tkiva i stanica u tekućinu/ otopinu
-idealni slučaj je da se radi sa svježim tkivom a to je praktički nemoguće što znaći da moramo upotrijebiti nužno zlo to jest smrzavanje tkiva
-tijekom smrzavanja tkiva dolazi do kristalizacije molekula vode i to oštećuje samo tkivo to jest može doći do velikih promjena PH i uništenja raznih proteina
-SONICIRANJEM (to jest izlaganjem ultrazvučnim valovima) homogeniziramo tkivo
NA TEMELJU KOJIH OSOBINA MOLEKULA SE DIJELE METODE PROČIŠĆIVANJA?
-naboj, veličina, polarnost, specifičnost
OPIŠI SEDIMENTACIJSKE METODE.
-imamo dvije metode jedna je CENTRIFUGIRANJE , a druga je PRECIPITACIJA/ TALOŽENJE
CENTRIFUGIRANJE
-metoda kojom razdvajamo molekle na temelju razlika u taloženju pri jačoj gravitacijskoj sili
-diferencijalno centrifugiranje (prvo soniciramo to jest ultrazvučnim valovima stavramo homogenat koji nakon toga centrifugiramo, centrifugom dobivamo talog i supernatant, supernatant odvajamo od taloga te ponavljamo proces dok se talog više ne stavra)
*centrifugiranje u gradijentu gustoće (pripremi se otopina različitih gustoća te se tijekom centrifugiranja dijelovi našeg uzorka otapaju to jest zaustavljaju ne svojem gradijentu idealne gustoće)
PERCIPITACIJA/TALOŽENJE
-metoda taloženja promjenom različitih uvijeta u otopini
-promjena temperature (denaturacija proteina), promjena ionske jakosti, taloženje organskim reagensima i afinitetno taloženje
OPIŠI ISOLJAVANJE
-isoljavanje ili salting out je metoda smanjenje topljivosti proteina tj. njihovog taloženja dodavanjem veće koncentracije soli, povećanjem ionske jakosti
-primjer. taloženje amonij sulfatom
KAKO MOŽEMO UKLONITI MALE MOLEKULE
-dijalizom i gel filtracijom
OPIŠI DIJALIZU
- stavimo u tubu za dijalizu naš homogenat i tu tubu stavimo u neku otopinu
-tuba za dijalizu je propusna za male molekule tj. ione a ne za velike molekule proteine
-molekule teže doći do stanja ravnoteže izjednačavanjem koncentracije
-ako više puta izmjenimo tekućinu u kojoj se nalazi tuba za dijalizu, a to je najčešće neki pufer možemo ukloniti većinu iona
NIKADA NEMOŽEMO UKLONITI SVE IONE!!!
OPĆENITO OPIŠITE KROMATOGRAFSKE TEHNIKE
-sastoje se od stacionarne faze i pokretne/mobilne faze
-molekule se unutar kromatografa mogu nalaziti na tri mjesta, slobodne u mobilnoj fazi, adsorbirane na stacionarnoj fazi i ako se radi o gel kromatografiji može se uvući u same pore gela ako su manje od pora
KAKO DIJELIMO KROMATOGRAFIJE
-tekućinska kromatografije
-kromatografija na papiru (u koloni i plinska)
-tankoslojna kromatografija
OPIŠI GEL FILTRACIJU
-gel filtracija je tip kromatografije u kojoj nema adsorpcijskih interakcija
-odjeljivanje se isključivo temelji na veličini molekula
-manje molekule mogu ući u pore gela te sporije prolaze nego velike molekule koje samo idu između kuglica gela
-tom metodom možemo približno odrediti Mr proteina
OPIŠI KROMATOGRAFIJU U KOLONI
-ovo je slučaj gdje se molekule razdvajaju na temelju adsorpcijskih afiniteta
-radi se o ionsko izmjenjivačkoj koloni koja može biti ANIONSKA (izmjenjuje anione) ili KATIONSKA (izmjenjuje katione)
-mi tako odvajamo naše proteina od ostatka otopine (uglavnom se proteini vežu za kolonu)
KAKO MIČEMO NAŠE MOLEKULE S KOLONE:
1. ispiremo otopinom suprotnog PH, tima ako imamo anion ispiremo otopinom vrlo niskog PH te taj naš anion mijenja naboj i nemože se više vezati za kolonu
2. ispiremo otopinom koja je koncentrirana anionima te oni istiskuju naš anion s kolone i on prolazi kroz nju
3. naši proteini se vežu na adsorbens tj. gel pomoću nekih liganada e sada mi možemo kroz kolonu pustiti otopinu punu tih liganada te će se proteini u otopini vezati za njih ili pustiti otopinu koja ima molekule koje imaju veći afinitet prema ligandu od naših proteina te će ih istisnuti
KOJE SU METODE DETEKCIJE PROTEINA
-UV SPEKTROFOTOMETRIJA
-denaturirani proteini imaju mogućnost bolje absorbancije valnih duljina do 280nm te mijerenjem apsorbancije možemo zaključiti ima li u našoj otopini proteina
-Beer-Lambertov zakon (a= Elc)
-vrijedi za aromatske kiseline
-SDS-PAGE
-vizualna promjena
-detekcija pomoću električnog polja
-KOLORIMETRIJSKI TESTOVI
-promjena boje otopine proporcionalna koncentraciji proteina
-Commoise blue
KOJE VRTSE MEDIJA MOGU BIIT NOSAČI ZA ELEKTROFOREZU
-agarozni gel
-papir
-celuloza
-škrobni gel
-poliakrilamidni gel
ŠTO SVE UTJEČE NA ELEKTROFOREZU
-električno polje
-uzorak
-pufer
-elektroforetski medij
ŠTO JE SDS-PAGE ELEKTROFOREZA
-poliakrilamidna denaturirajuća gel elektroforeza
-gel se radi od natrij dodecil sulfata
-razdvajanje te temelji na brzini gibanja čestića u električnom polju poliakrilamidnog gela
-zbog SDS sve su molekule negativno nabijene (zbog natrij dodecil sulfata) i sve idu prema anodi (prema dolje)
-MOLEKULE SE IZDVAJAJU SAMO NA OSNOVI MASE I VELIČINE
-prije nego što se proteini stave u poliakrilamidni gel moraju se denaturirati
-SDS PAGE se sastoji od dva gela
-SABIJAJUĆI GEL-prvi, njegova uloga da svi proteini imaju istu startnu poziciju
-RAZDVAJAJUĆI GEL-drugi, mreža koja razdvaja proteina temeljem njihove brzine putovanja
-dvije tanka staklene ploče između kojih se nalaze gelovi i one su s obje strane uronjene u pufer
-manje molekule brže putuu kroz gel, brzina putovanja je obrnuto proporcionalna logaritmu Mr
-bojenje se odvija nakon što se elektroforeza završi
ZA ŠTO KORISITMO SDS PAGE
-određivanje Mr proteina
-određivanje o kojem je proteinu riječ
-određivanje mase proteinskih podjedinica
-određivanje čistoće uzorka
-utvrđivanje prisutnih disulfidnih mostova
-kvantifikacija proteina
