Tecnicas moleculares en el estudio genetico Flashcards
¿Que es la medicina de precision?
Se basa en la premisa de que cada individuo es unico a nivel genetico y que estas diferencias pueden influir en la susceptibilidad a enfermedades y en la eficacia y seguridad de los tratamientos
¿Cuales son las tecnicas moleculares en la medicina de precision?
- Diagnostico genetico
- Farmacogenomica
- Oncologia molecular
- Medicina preventiva
¿Que es la farmacogenomica?
El estudio de como las variantes geneticas (alelicas) influyen en la respuesta (metabolizacion) de farmacos
¿Que es la oncologia molecular?
El estudio de genes implicados en el cancer y las proteinas cuyas sintesis ordenan esos genes
¿Cuales son las tecnicas de amplificacion de ADN?
- PCR
- qPCR
¿Que elementos se necesitan para realizar un PCR?
- Una ADN polimerasa: Taq polimerasa
- 2 cebadores para cada reaccion
¿Cuales son los pasos del PCR?
- Desnaturaliación: para conseguir hebras simples
- Templado: se unen los cebadores a sus secuencias complementarias
- Extensión: la Taq polimerasa extiende los cebadores y sintetiza asi nuevas cadenas de ADN duplicadas
¿Cuales son las aplicaciones del PCR?
- Diagnostico de enfermedades geneticas mediante la deteccion de mutaciones especificas
- Estudios de expresión genetica mediante RT-PCR
- Analisis de polimorfismos geneticos como SNPs
- Clonaccion de genes y construccion de bibliotecas de ADN
- Deteccion de patogenos y enfermedades infecciosas
- Analisis forense y estudios de identificacion
¿Que es RT-PCR?
PCR con transcriptasa inversa
¿Como funciona el RT-PCR?
Se analiza ARN, como por ejemplo, ARNm con transcriptasas inversas (que son enzimas que tienen los virus) que transcriben ARN a ADN
¿Por que el PCR sirve para el diagnostico genetico, identificacion de polimorfismos, etc?
Porque los cebadores que usan son altamente específicos para ciertas secuencias, por ende si la mutacion esta presente, da positivo
¿El PCR sirve para identificar donde esta especificamente la secuencia en el ADN?
No. Solo nos indica si esta la mutacion pero no donde y cuales nucleotidos involucra
¿Por que se diferencia el qPCR del PCR?
Porque se utiliza una tecnica de deteccion en tiempo real que permite medir la cantidad de ADN amplificado en el ensayo
¿Que se utiliza en el qPCR para cuantificar el ADN?
Tintes o sondas fluorescentes
¿Como se cuantifica el ADN en el qPCR?
En cada ciclo se mide la señal que emite la sonda fluorescente, cuya intensidad aumenta a medida que aumenta la cantidad de ADN amplificado
¿A que nos referimos con el umbral de expresion en el qPCR?
Se establece que despues de cierta cantidad de ciclos se debe tener una cierta cantidad de ADN para considerar que el qPCR sea positivo
¿Cuales son las aplicaciones clinicas del qPCR?
- Diagnostico y monitorizacion de enfermedades infecciosas
- Oncologia
- Diagnostico prenatal no invasivo
- Farmacogenomica
- Transplantes
¿Que tecnicas nos permiten identificar la secuencia de los nucleotidos en un fragmento de ADN una vez que esta fue amplificada?
Tecnicas de secuenciacion del ADN
¿Cuales son las tecnicas de secuenciacion del ADN?
- Secuenciacion de Sanger/Metodo por terminación de cadena
- Secuenciacion de nueva generacion (NGS)/Secuenciacion masiva en paralelo
¿Que elementos se utilizan en la Secuenciacion de Sanger?
- ADN polimerasa
- Cebadores
- Los cuatro nucleotidos del ADN
- Molde de ADN
- Didesoxis/terminadores de cadena
¿Que son los didesoxis y como funcionan?
Son nucleotidos alterados que no tienen un grupo OH en el 3C del anillo de la azucar.
Esta modificacion evita que se puedan unir más nucleotidos a la cadena y por eso se llaman terminadores.
Estos estan marcados con tintes diferentes para cada tipo base
¿Cuales son las limitaciones de la secuenciacion de Sanger?
- Solo se puede utilizar para lectura de secuencias cortas (600-700 nucleotidos)
- Es costoso
¿Cuales son los pasos de la secuenciacion de Sanger?
- Se amplifica el ADN al igual que en un PCR, con la excepción de que la ADN polimerasa añade didesoxis a cada cadena
- Se van añadiendo cada vez más didesoxis a menos distancia de nucleotidos (uno a la vez) hasta que llega a la utlima hebra que para justo despues del cebador
- Los fragmentos se hacen pasar por un electroforesis, donde los fragmentos más chicos avanzan mas
- Se identifica cada base gracias a los tintes
¿Cuales son las aplicaciones de la secuenciacion de Sanger en el diagnostico genetico?
- Diagnostico de enfermedades hereditarias
- Analisis de genes supresores de tumores
- Diagnostico prenatal no invasivo
- Confirmación de resultados de otras tecnicas (como PCR)
¿Como se diferencia la secuenciacion NGS de la de Sanger?
La NGS es un proceso masivo, con varios cebadores colocados y varias amplificaciones ocurriendo a la vez. permite la lectura de cadenas mas largas
¿A que nos referimos con biblioteca de ADN?
Es una representacion de todos los genes de un organismo
¿Cuales son las aplicaciones clinicas de la NGS?
- Diagnostico de enfermedades geneticas
- Oncologia de precision
- Diagnostico prenatal no invasivo
- Farmacogenomica
- Vigilancia de enfermedades infecciosas
¿Que son los microarrays?
Es una tecnica para estudiar muchos genes a la vez/su expresion
¿Como funcionan los microarrays?
- Se colocan miles de secuencias de ADN conocidas sobre un chip (portaobjetos)
- Una muestra que contiene ADN o ARN se coloca sobre el chip
- El apareamiento de las bases complementarias entre la muestra y las secuencias de genes en el chip produce una cantidad de luz que se puede medir. Las áreas del chip que producen luz identifican los genes que se expresan en esa muestra.
¿Cuales son las aplicaciones de los microarrays?
- Identificación de genes y vías de señalización asociados a enfermedades
- Desarrollo de firmas de expresión génica para el diagnóstico y pronóstico
- Farmacogenómica y respuesta a fármacos
- Descubrimiento de nuevos biomarcadores
- Estudios de toxicogenómica
¿Que son los marcadores moleculares?
Son secuencias identificables de ADN que se encuentran en lugares especificos del genoma y que están relacionadas con la herencia de una característica o de un gen vinculado a ésta.
¿Cuales son los tipos de marcadores moleculares?
- Polimorfismos de un solo nucleotido (SNPs)
- Microsatelites y minisatelites
- Inserciones y deleciones (INDELs)
¿Que son los SNPs?
Los polimorfismos de un solo nucleótido se presentan cuando un solo nucleótido (elemento fundamental del ADN) es reemplazado por otro.
¿Que son los microsatelites?
Son repeticiones de secuencias cortas de nucleótidos a través del ADN, de gran importancia debido a su carácter polimórfico que permite su utilización en la identificación genética de individuos o poblacionales.
¿Que es la genotipificacion?
El proceso de determinación del genotipo de una variante en el ADN específico de un organismo biológico, mediante un procedimiento de laboratorio.
¿Cuales son las tecnicas de genotipificacion?
- Basada en PCR
- Basada en hibridación (Microarrays, sondas taqman)
- por secuenciacion (NGS)
¿Que son los GWAS?
Estudios de asociacion genetica
¿Cual es el objetivo de los GWAS?
Identificar las variantes geneticas de la poblacion
¿Que tipo de variantes encuentran los GWAS?
Variantes/enfermedades comunes
