Técnicas de DPN Flashcards
Quais as técnicas de DPN e o que permite diagnosticar cada uma?
- Amniocentese - anormalias cromossomais
- Biopsia das vilosidades coriônicas - analise de enzimas e DNA, anomalias cromossomais.
- Ultrassom - localização da placenta e detecção de malformações estruturais (membros, tubo neural, coração, entre outros)
- Recolha de sangue de amostras fetais - talassemia e doenças relacionadas; outras doenças hematológicas e metabólicas
- Testes bioquímicos no soro materno - β-hCG e PAPP-A (sindrome de Down entre as 11 e 14 semanas) e a-fetoproteina (tubos neurais defeituosos e sindrome de Down a partir das 14 semanas)
- Análise de células fetais na circulação materna - biologia molecular (qPCR)
Quando se faz uma amniocentese?
Por ter um risco de aborto (0,5%), apenas se faz depois de dois testes bioquimicos positivos (β-hCG e PAPP-A) e uma ecografia positiva
Em que consiste a aminocentese?
Recolha de liquido fetal que contem células fetais (de onde depois se retira o DNA para fazer testes)
A amniocentese considera-se uma tecnica de diagnostico?
Não. A técnica em si apenas permite recolher as células, de onde depois e retirado o DNA para fazer os testes, como o de cariótipo e esse sim e um teste de diagnostico.
Apos a amniocentese, as células fetais são separadas do liquido amniótico através de _________.
Centrifugação
Apos a centrifugação do liquido amniótico, forma-se um pellet e um sobrenadante. Que técnicas podem ser realizadas a partir de cada um?
Sobrenadante: testes bioquímicos (ex: alfa-fetoproteina)
Pellet pode ter dois destinos:
* cultura de células: analise cromossomais (cariótipo) e DNA
* sem cultura de células: analise direta do DNA (FISH e PCR)
A biopsia das vilosidades corionicas realiza-se numa fase mais ________ que a amniocentese.
Inicial. O teste pode ser feito ate as 10 semanas.
No DPN, a citogenetica permite detetar _____________ e a biologia molecular permite detetar ___________.
- anormalias cromossomais (que podem afetar vários genes)
- risco de uma alteração genética num gene/proteína
Fazer uma analise direta do DNA por FISH ou PCR pode ser mais vantajoso por ser mais _________ do que analise de cariótipo através de uma cultura de células.
Rápido - resultados em 24-48 horas ao contrario da cultura de células que pode demorar entre 1 e 3 semanas
Pode-se analisar o cariótipo através de vilosidades coriônicas?
Não, por não existir material suficiente
Protocolo para analise de cariótipo:
- Recolha de sangue venoso
- Adiçao de fitohemaglutinina para estimular a divisao de linfocitos T
- Cultura de celulas a 37ºC durante 3 dias
- Adicionar colchichina (que vai bloquear a divisao das celulas na metafase, fase onde os cromossomas se encontram mais condensados)
- Adicionar uma soluçao salina, para provocar a lise das celulas, libertando o seu conteudo
- Fixar as celulas
- Espalhar as celulas numa lamina por dropping
- Digerir conteudo proteico com tripsina e colorar com Giemsa
- Analisar os cromossomas e desenhar o cariotipo.
Caracterizar o bandeamento G (Giemsa):
Utilizaçao de um molécula que se liga a zonas ricas em GC (regioes com transcricidade elevada, correspondendo a eucromatina/genes) Assim, as zonas escuras correspondem a zonas gene-rich e as zonas claras a gene-poor.
Caracterizar o bandeamento Q (quinacrina):
Marcar as regiões CG com fluorescencia.
O bandamento Q, em relação ao bandeamento G, é uma técnica:
Mais cara mas mais sensível
Caracterizar o bandeamento R (Reverse):
Os cromossomas sao desnaturados por aquecimento e depois cora-se com Giemsa. Por ja nao existirem pontes de hidrogênio, vao ser coradas as zonas AT
Quando se realiza o bandeamento R?
Quando existem duvidas relativamente ao bandeamento G
Caracteriza o bandeamento C:
Tratamento de cromossomas com ácido seguido de base antes da adição do Giemsa. O centrómero e as regiões heterocromáticas que contêm sequências repetitivas são coradas preferencialmente.
Porque se deve analisar o cariótipo de 10 a 15 celulas?
Para verificar se estamos perante uma situação de mosaicismo. Se se suspeitar de mosaicismo devem ser analisadas pelos menos 30 células.
O que se pode fazer para aumentar a resolução das bandas?
Analisar os cromossomas ligeiramente antes da metafase (na profase ou na pro-metafase). Para isso, adiciona-se metotroxano ou timidina seguido de acido fólico e colchichina.
Qual a base da técnica FISH?
Utilização de sondas fluorescentes que hibridam numa zona especifica cromossomal, permitindo identificar e localizar sequencias.
Passos básicos para a técnica do FISH?
- Desnaturar DNA
- Hibridar as sondas
- Microscopia de fluorescencia
Tipos de sondas (geral)
- Corantes (Painting) - coram o cromossoma inteiro
- centromericas (coram o centromero)
- especificas para sequencia
- telomericas
Para que se utilizam as sondas painting?
- Analise numérica de cromossomas (detetar trissomias)
- Analisar translocações entre cromossomas
- Analisar perda de cromossomas (perda de um X ou Y)
- Identificar cromossomas derivativos (cromossomas que possuem material genético de outro cromossoma)
A combinaçao de uma sonda especifica a um sequencia com uma sonda que identifique o cromossoma permitem identificar:
- deleções
- duplicações
- translocações
- inversões
Ex: sindrome Prader-Willi/Angelman, Williams e DiGeorge
