Técnicas de DPN

Question 1

Quais as técnicas de DPN e o que permite diagnosticar cada uma?

Answer 1

• Amniocentese - anormalias cromossomais
• Biopsia das vilosidades coriônicas - analise de enzimas e DNA, anomalias cromossomais.
• Ultrassom - localização da placenta e detecção de malformações estruturais (membros, tubo neural, coração, entre outros)
• Recolha de sangue de amostras fetais - talassemia e doenças relacionadas; outras doenças hematológicas e metabólicas
• Testes bioquímicos no soro materno - β-hCG e PAPP-A (sindrome de Down entre as 11 e 14 semanas) e a-fetoproteina (tubos neurais defeituosos e sindrome de Down a partir das 14 semanas)
• Análise de células fetais na circulação materna - biologia molecular (qPCR)

Question 2

Quando se faz uma amniocentese?

Answer 2

Por ter um risco de aborto (0,5%), apenas se faz depois de dois testes bioquimicos positivos (β-hCG e PAPP-A) e uma ecografia positiva

Question 3

Em que consiste a aminocentese?

Answer 3

Recolha de liquido fetal que contem células fetais (de onde depois se retira o DNA para fazer testes)

Question 4

A amniocentese considera-se uma tecnica de diagnostico?

Answer 4

Não. A técnica em si apenas permite recolher as células, de onde depois e retirado o DNA para fazer os testes, como o de cariótipo e esse sim e um teste de diagnostico.

Question 5

Apos a amniocentese, as células fetais são separadas do liquido amniótico através de _________.

Answer 5

Centrifugação

Question 6

Apos a centrifugação do liquido amniótico, forma-se um pellet e um sobrenadante. Que técnicas podem ser realizadas a partir de cada um?

Answer 6

Sobrenadante: testes bioquímicos (ex: alfa-fetoproteina)

Pellet pode ter dois destinos:
* cultura de células: analise cromossomais (cariótipo) e DNA
* sem cultura de células: analise direta do DNA (FISH e PCR)

Question 7

A biopsia das vilosidades corionicas realiza-se numa fase mais ________ que a amniocentese.

Answer 7

Inicial. O teste pode ser feito ate as 10 semanas.

Question 8

No DPN, a citogenetica permite detetar _____________ e a biologia molecular permite detetar ___________.

Answer 8

• anormalias cromossomais (que podem afetar vários genes)
• risco de uma alteração genética num gene/proteína

Question 9

Fazer uma analise direta do DNA por FISH ou PCR pode ser mais vantajoso por ser mais _________ do que analise de cariótipo através de uma cultura de células.

Answer 9

Rápido - resultados em 24-48 horas ao contrario da cultura de células que pode demorar entre 1 e 3 semanas

Question 10

Pode-se analisar o cariótipo através de vilosidades coriônicas?

Answer 10

Não, por não existir material suficiente

Question 11

Protocolo para analise de cariótipo:

Answer 11

1. Recolha de sangue venoso
2. Adiçao de fitohemaglutinina para estimular a divisao de linfocitos T
3. Cultura de celulas a 37ºC durante 3 dias
4. Adicionar colchichina (que vai bloquear a divisao das celulas na metafase, fase onde os cromossomas se encontram mais condensados)
5. Adicionar uma soluçao salina, para provocar a lise das celulas, libertando o seu conteudo
6. Fixar as celulas
7. Espalhar as celulas numa lamina por dropping
8. Digerir conteudo proteico com tripsina e colorar com Giemsa
9. Analisar os cromossomas e desenhar o cariotipo.

Question 12

Caracterizar o bandeamento G (Giemsa):

Answer 12

Utilizaçao de um molécula que se liga a zonas ricas em GC (regioes com transcricidade elevada, correspondendo a eucromatina/genes) Assim, as zonas escuras correspondem a zonas gene-rich e as zonas claras a gene-poor.

Question 13

Caracterizar o bandeamento Q (quinacrina):

Answer 13

Marcar as regiões CG com fluorescencia.

Question 14

O bandamento Q, em relação ao bandeamento G, é uma técnica:

Answer 14

Mais cara mas mais sensível

Question 15

Caracterizar o bandeamento R (Reverse):

Answer 15

Os cromossomas sao desnaturados por aquecimento e depois cora-se com Giemsa. Por ja nao existirem pontes de hidrogênio, vao ser coradas as zonas AT

Question 16

Quando se realiza o bandeamento R?

Answer 16

Quando existem duvidas relativamente ao bandeamento G

Question 17

Caracteriza o bandeamento C:

Answer 17

Tratamento de cromossomas com ácido seguido de base antes da adição do Giemsa. O centrómero e as regiões heterocromáticas que contêm sequências repetitivas são coradas preferencialmente.

Question 18

Porque se deve analisar o cariótipo de 10 a 15 celulas?

Answer 18

Para verificar se estamos perante uma situação de mosaicismo. Se se suspeitar de mosaicismo devem ser analisadas pelos menos 30 células.

Question 19

O que se pode fazer para aumentar a resolução das bandas?

Answer 19

Analisar os cromossomas ligeiramente antes da metafase (na profase ou na pro-metafase). Para isso, adiciona-se metotroxano ou timidina seguido de acido fólico e colchichina.

Question 20

Qual a base da técnica FISH?

Answer 20

Utilização de sondas fluorescentes que hibridam numa zona especifica cromossomal, permitindo identificar e localizar sequencias.

Question 21

Passos básicos para a técnica do FISH?

Answer 21

1. Desnaturar DNA
2. Hibridar as sondas
3. Microscopia de fluorescencia

Question 22

Tipos de sondas (geral)

Answer 22

1. Corantes (Painting) - coram o cromossoma inteiro
2. centromericas (coram o centromero)
3. especificas para sequencia
4. telomericas

Question 23

Para que se utilizam as sondas painting?

Answer 23

• Analise numérica de cromossomas (detetar trissomias)
• Analisar translocações entre cromossomas
• Analisar perda de cromossomas (perda de um X ou Y)
• Identificar cromossomas derivativos (cromossomas que possuem material genético de outro cromossoma)

Question 24

A combinaçao de uma sonda especifica a um sequencia com uma sonda que identifique o cromossoma permitem identificar:

Answer 24

• deleções
• duplicações
• translocações
• inversões

Ex: sindrome Prader-Willi/Angelman, Williams e DiGeorge

Question 25

Tipos de combinação de sondas especificas de sequencia:

Answer 25

• single fusion: sondas com cores diferentes para cada gene (que estão em cromossomas diferentes) envolvido na translocação; se ocorrer translocação, as sondas irão surgir no mesmo cromossoma
• break apart: sondas com cores diferentes para as duas partes de um mesmo gene envolvido na translocação; se ocorrer translocação, as duas sondas afastam-se

Question 26

Utilizam-se sondas telomericas para identificar casos de:

Answer 26

Atraso mental idiopatico

Question 27

Porque foi desenvolvida CGH ( Comparative Genomic Hibridation)

Answer 27

Para superar a dificuldade de obter metáfases de boa qualidade em tumores sólidos.

Question 28

Descreve a técnica do CGH:

Answer 28

O DNA tumoral marcado com vermelho (Cy5) e o DNA normal marcado com verde (Cy3). Depois, numa lamina de vidro, são hibridados com cromossomas normais em metáfase, onde vão competir pela ligação aos mesmos.

Question 29

Como interpretar os resultados obtidos de CGH:

Answer 29

• se a amostra tumoral tem mais DNA que o controlo (resultante de duplicações) há um aumento da intensidade da fluorescência vermelha
• se o DNA tumoral tiver deleções, há mais fluorescência verde
• se houver a mesma quantidade de DNA a fluorescência resultante é a mistura das duas – amarela (tumor sem alteração nesse gene)

Question 30

Aplicação de CGH:

Answer 30

Diagnostico pré-natal a partir de uma única célula (depois do DNA ser amplificado - são necessárias várias cópias).

Question 31

Limitações de CGH:

Answer 31

• Resolução baixa: só deteta perdas superiores a 10 Mb e ganhos superiores a 2 Mb
• Limitações técnicas - utilização de cromossomas

Question 32

Técnica de array-CGH:

Answer 32

Semelhante ao CGH mas utiliza-se uma placa com poços, onde em cada um dos poços estao oligonucleotidos das regioes que queremos estudar do genoma, com que vao hibridar as regioes de DNA tumoral e normal marcados com os fluoroforos (vermelho e verde, respetivamente)

Question 33

Quais as desvantagens destas ultimas técnicas (CGH e array-CGH)?

Answer 33

Requerem leitores de fluorescência e mais do que uma copia da região para garantir que o resultado é fiável. Para além disso, tem que se garantir que o DNA da amostra esta puro.