Sequenciação DNA

Question 1

Como se procede à purificação dos produtos de PCR antes da sequenciação:

Answer 1

Com duas enzimas:
* Exonuclease I - hidrólise de ssDNA (como primers residuais)
* Fosfatase alcalina - hidrólise de dNTPs

Question 2

Quais os nucleótidos utilizados para a sequenciação de Sanger:

Answer 2

• dNTPS
• ddNTPs (não têm o grupo OH que permite que reaja com o grupo fosfato do próximo dNTP e assim a reação para) - marcados com fluoróforo

Question 3

Mecanismo de sequenciação de Sanger:

Answer 3

São criados fragmentos com diferentes tamanhos (pois a reação pára sempre que um dd-NTP é incorporado) → fragmentos separados por eletroforese capilar e passam por um laser que lê o fluoróforo (cada ddNTP estava associado a um fluoróforo específico) → informação passada ao computador que monta a sequência de DNA num cromatograma

Question 4

Aplicações da sequenciação de Sanger:

Answer 4

→ Sequenciação de DNA e cDNA
→ Análise de Metilação
→ Análise de microssatélites
→ Fingerprinting

Question 5

Desvantagens de sequenciação de Sanger:

Answer 5

Mais demoroso que um qPCR

Question 6

Não é recomendada a sequenciação de Sanger para diagnóstico quando:

Answer 6

→ Este é urgente
→ Não se sabe o gene associado ao fenótipo
→ Numero de genes a analisar é muito grande
→ Tamanho de um gene é muito grande, não existem hotspots de mutação e a doença é rara.

Question 7

A NGS permite a análise de:

Answer 7

Sequências de várias amostras em simultâneo.

Question 8

Fases de NGS:

Answer 8

1. Preparação da biblioteca
2. Amplificação (PCR)
3. Sequenciação
4. Análise de Dador

Question 9

NGS é útil na análise de doenças:

Answer 9

Multifatoriais

Question 10

Distingue os dois diferentes métodos de preparação da biblioteca:

Answer 10

Fragmentação do DNA e ligação a adaptadores (complementares a primers universais)
* PCR de emulsão (em fase líquida): pequenas emulsões (gotículas) em óleo e cada gotícula serve como centro de amplificação onde tem os primers suspensos na solução PCR e biotinados → biotina serve como ponte de ligação a uma esfera e os fragmentos amplificados ficam também ligados em redor da esfera
* PCR em ponte (em fase sólida): adaptadores A e B ligam-se a uma matriz sólida aos primers complementares (annealing) e depois ocorre a polimerização pela DNA polimerase

Question 11

Que química de sequenciação utiliza Roche 454. Explica o método?

Answer 11

Pirosequenciação: uma mistura de um d-NTP específico é adicionada de cada vez → cada reação da polimerase (ligação de um d-NTP) liberta um grupo fosfato → convertido a ATP pela ATP-sulfurilase → a luciferase utiliza o ATP numa reação que produz luz → assim, quando há a ligação de um d-NTP é detetada luz → adiciona-se a enzima apirase que elimina os restos de nucleótidos e ATP → adiciona-se uma nova mistura de outro d-NTP

Question 12

Desvantagem de Roche 454:

Answer 12

→ Caro (4 enzimas)
→ lento (amplificação de fragmentos muito grandes)

Question 13

Em que princípio se baseia a Ion Torrent?

Answer 13

A cada ligação de um nucleótido (catalisada pela polimerase) é libertado um H+ → alteração do pH → medição do pH

Question 14

Porquê é que NGS ainda é pouco utilizado em prática clínica?

Answer 14

O grande entrave à sua utilização é, não só a existência de doenças multifatoriais e a sua variabilidade clínica que aumentam a complexidade da análise dos resultados obtidos, como a falta de conhecimento sobre o nosso próprio genoma. Numa sequenciação podem-se obter variantes no genoma cujo significado não se conhece, sendo por isso classificadas como variantes de significado desconhecido. Exemplos:
* variantes em genes que estão associados a doenças, mas continua a não se saber se essa variante em questão provoca doença ou não.
* regiões não são codificantes, mas tanto podem ter impacto e provocar doença como não.
Daí que em termos médicos as conclusões que se podem apresentar ao paciente são poucas ou nenhumas e que a sua utilização seja pouca.

Question 15

Mecanismo de NGS de 3º Geração do Nanopore:

Answer 15

d-NTP marcado com uma tag que origina uma corrente elétrica (diferencial em cada d-NTP) → a ligação pela DNA Polimerase à cadeia provoca a libertação da tag → tag atravessa um nanoporo (embebido numa camada bi-lipidica) e vai gerar uma corrente elétrica → deteção da corrente elétrica e associação com o nucleótido

Question 16

Vantagens do nanopore:

Answer 16

→ capacidade de conseguir sequenciar a partir de uma única molécula de DNA (sem amplificação)
→ lê fragmentos longos
→ análise em tempo real
→ pode sequenciar DNA ou RNA
→ sequenciar com precisão regiões repetitivas

Question 17

Potenciais aplicações de NGS no diagnóstico clínico:

Answer 17

1. “Persinal genomics”
2. Prognóstico de cancro e terapêutica
3. Screening pre-natal & terapêutica
4. Microbiologia
5. Immunoprofiling
6. Genética médica