Aplicações em Genética Médica pt2 Flashcards
O PCR em tempo real ou quantitativo (qPCR) permite:
- Monitorizar/acompanhar ao longo do tempo a reação de PCR
- Quantificar a amostra inicial
Depois de cada ciclo, a quantidade de DNA ____________.
Duplica (aumento exponencial)
Fases da curva exponencial de qPRC:
- Fase lag - a duração desta fase é inversamente proporcional à concentração do material no início
- Fase exponencial
- Fase estacionária
O que permite acompanhar em qPCR, a amplificação do DNA em tempo real?
A utilização de fluoróforos (é necessário que o termociclador possua um detetor de fluorescência)
Comparação entre PCR e qPCR?
- PCR é mais fácil, mas obtém-se menos resultados, permitindo apenas a deteção do produto no fim do PCR e é necessário correr em gel. Permite genotipagem, descriminação alélica, deteção de SNPs, mutações pontuais, inserções e deleções
- q-PCR permite obter resultados mais complexos e saber se o produto está a ser amplificado durante a reação ou não. Permite obter quantificação absoluta ou relativa e fazer, também, genotipagem
Distinção entre quantificação absoluta e relativa no qPCR:
- absoluta - necessária curva de calibração feita a partir de tresholds obtidos com amostras de concentração conhecida
- relativa - comparação com housekeeping genes
Sistemas que existem para a deteção no qPCR:
- Flurocromos específicos para dsDNA que emitem fluorescência
- SyBr green
- Sondas de hibridização
- Sondas de clivagem (TaqMan)
- Sondas de deslocamento (Molecular beacons, FRET)
- Oligonucleótidos com fluoróforos incorporados
Mecanismo das SbBr green, vantagens e desvantagens:
- Reconhece e liga-se ao dsDNA, de forma inespecífica de sequência, pelo que existe sinal durante a fase de polimerização ou extensão
- Vantagens: técnica mais barata
- Desvantagem: liga-se a qualquer cadeia dupla (DNA ou RNA) sendo melhor eletroforese no final para verificar
Mecanismos das sondas de clivagem (TaqMan) e vantagens:
- A sonda possui um fluoróforo a 5’ e um quencher a 3’. O quencher inibe a fluorescência do fluorocromo quando na sua proximidade, pelo que se garante que não há sinal de sonda não hibridada. Quando a Taq Polimerase está a estender os primers cliva a sonda com a sua atividade 5’-3’ exonuclease e este é liberto para longe do quencher ganhando fluorescência. Assim, nestas sondas a deteção é feita durante o passo de extensão
- Vantagens: especificidade (hibridam num local dentro da sequência a amplificar) e é tudo realizado num tubo fechado (pouco risco de contaminação)
Mecanismo do Molecular Beacons:
- Estrutura em hairpin complementar a uma sequência alvo, com o fluoróforo a 5’ e o quencher a 3’, de modo que a estrutura hairpin garante a proximidade dos dois e a ausência de fluorescência. A zona de hairpin é a que se liga ao DNA e, ao hibridar, essa zona “abre” e o quencher afasta-se do fluoróforo e este emite fluorescência → deteção na fase de annealing
- Para se ligar ao DNA, é necessário que a energia de Gibbs da sonda que faz com que forme um hairpin seja vencida pela energia de Gibbs de emparelhamento (DNA-sonda), pelo que emparelha com uma sequência muito específica.
Mecanismo das sondas FRET:
- Duas sondas com fluoróforo: R1(dador) e R2 (aceitador) que hibridam em locais muito próximos (1-5 bp de distância) do DNA alvo
- Quando ocorre hibridação das sondas com o DNA, os fluoróforos ficam próximos o suficiente para que haja transferência de eletrões do fluoróforo dador para o aceitador, de modo que este ganha fluorescência
- Deteção durante a fase de annealing.
- Muito sensível porque implica a hibridação de duas sondas no local correto.
Mecanismo das sondas Dual fret e molecular beacons:
- É uma mistura das outras duas
técnicas: duas sondas que têm fluoróforos dador e aceitador, mas são em estrutura de hairpin com um quencher associado a cada um → hibridização dos molecular beacons dador e aceitador em regiões adjacentes na sequência e o dador excita o aceitador e este emite fluorescência. - Mais sensível e específica: evita os problemas das sondas molecular beacon (deteção devido a degradação das sondas e interações não específicas); como são sondas maiores a especificidade de ligação é também maior.
- A técnica mais cara
Vantagens do qPCR:
- Específico
- Simples, rápido
- Sensível - amplificação a partir de pequenas quantidades
- Flexível
Desvantagem do qPCR:
- Equipamento e reagentes mais caros
A técnica HRM (High Resolution Melting) permite:
Identificar mutações/SNPs novos ou desconhecidos
Mecanismo do HRM:
qPCR com sondas que se ligam a dsDNA e que saturam o DNA (ligam-se em toda a sua extensão) → aumento rápido de temperatura → desnaturação e a fluorescência cai a pique → diminuição rápida da temperatura → cadeias ligam-se em regiões altamente complementares e em heterozigóticos formam-se 2 homoduplexes e 2 heteroduplexes (com a região não complementar) → fluorescência de volta ao máximo → aumento lento da temperatura → heteroduplexes, por serem mais instáveis, desnaturam e perdem a fluorescência primeiro (temperatura de melting mais baixo que os homoduplexes)
Vantagens do HRM:
- alta sensibilidade
- alta especificidade
- deteta alterações homozigóticas e heterozigóticas
- reproduzível
- rápida (2h)
- feita num único tubo fechado
- barata (sem enzimas)
HRM é uma técnica de rastreio ou diagnóstico?
Rastreio (não se procura algo específico). Se existir mutação, sequencia-se para saber qual é.
Assim, é uma técnica de rastreio rápida que evita Sanger em regiões desnecessárias.
Mecanismo de d-HPLC:
Após o PCR, desnaturação e formação de heteroduplexes e homoduplexes, associa-se a amostra a uma coluna de cromatografia carregada positivamente → DNA é negativo e por isso a molécula agarra-se e lava-se tudo o resto → eluição do DNA com um solvente orgânico → heteroduplexos são os primeiros a sair (por serem mais instáveis e, logo, têm menos afinidade com a coluna) → Medição da absorvância com um detetor UV (para analisar concentração)
Vantagens e Desvantagens de dHPLC:
- Vantagens: sensitividade e especificidade entre 96% e 100% ; deteção de mutações pontuais, pequenas deleções e inserções e múltiplos genes com múltiplas mutações
- Desvantagens: método semi-automático; custo de reagentes e coluna elevado; sensível à qualidade do DNA e ao tamanho dos fragmentos; poucas aplicações para doenças com um número de genes/exões elevado; técnica mais lenta
Qual a vantagem de MALDI-TOF?
Possui a sensibilidade de PCR e a precisão de espectrometria de massa
MALDI-TOF é uma técnica de ______ e permite ____________.
- Diagnóstico
- Deteção de doenças conhecidas e a genotipagem
Para genotipagem multiplex com MALDI-TOF é necessário que os primers tenham:
Tamanhos diferentes para garantir que migram a velocidades diferentes
Qual o mecanismo de MALDI-TOF?
Amplifica-se a região a estudar (e limpam-se os restos de d-NTPs) → reação tPlex (apenas um primer que emparelha adjacente à mutação e utilizam-se ddNTPs, pelo que só há extensão de um nucleótido → transferência dos fragmentos de DNA para o chip onde serão imobilizados → chip colocado num espectrómetro de massa → migração e separação dos fragmentos por tamanho → medição da massa dos fragmentos → indicação se a pessoa tem a mutação ou não
Vantagem de MALDI-TOF:
- Um único chip tem 348 poços, e em cada um pode ser detetadas até 40 mutações → boa técnica para deteção de mutações em larga escala
- Custo de reagentes é baixo
Desvantagem de MALDI-TOF:
- As mutações têm de ser conhecidas
Exemplo de uma doença onde pode ser aplicada a técnica de MALDI-TOF:
Miocardiopatia hipertrófica
Como interpretar os resultados do MALDI-TOF?
- verde - ocorreu muita amplificação
- verde/amarelo - ocorreu menos amplificação
- vermelho - não houve amplificação (controlos)
Quais as regiões dos primers utilizados na técnica MLPA?
- Zona específica de ligação a primers universais
- Stuffer sequence - tamanho diferente para os primers de genes diferentes, o que vai permitir distinguir os resultados
- Zona de hibridização para o DNA
O que permite detetar o MPLA?
- Ganhos ou perdas de repetições
- Sequências que diferem num único nucleótido e pode ser usada para detetar mutações pontuais conhecidas
Mecanismo de MPLA:
Vários pares de primers (de tamanhos diferentes) para diferentes genes são usados numa reação multiplex → cada par de primers para cada gene hibridam com o DNA de maneira a que a distância entre eles seja muito pequena para poderem ser unidos por uma ligase → se houver uma mutação (nem que seja de uma base), ganha ou perda de material genético (conforme o número de repetições da sequência em estudo vai ocorrer hibridação de mais ou menos primers e vamos ter mais ou menos destes fragmentos), os primers não são unidos pela ligase → primers depois são separados por eletroforese capilar e amplificados e quantificados por qPCR
