Aplicações na Genética Medica Flashcards
Datas importantes na biologia molecular:
* 1977
* 1985
* 1986
* 1987
* 2001
* 2007
* 2008
o 1977 – Allan Maxam e Walter Gilbert descrevem a sequenciação de DNA por reação química e Sanger descreve a sequenciação de DNA por síntese enzimática.
o 1985 – Kary Mullis et al. descrevem a reação em cadeia da polimerase (PCR).
o 1986 – Instituto de Tecnologia da Califórnia desenvolve a primeira plataforma para a sequenciação de DNA
o 1987 – Primeiro sequenciador de DNA automático da Applied Biosystems
o 2001 – Publicação do primeiro rascunho da sequência do genoma humano na Nature e na Science
o 2007 – Craig Venter sequência o seu próprio genoma e publica (primeiro genoma de um homem sequenciado).
o 2008 – Projeto dos 1000 genomas – consórcio internacional com o objetivo de sequenciar 1000 genomas de diferentes etnias para melhor perceber a variabilidade do genoma humano. No mesmo ano, o Centro Médico da Universidade de Leiden sequência o primeiro genoma de uma mulher e apareceram as plataformas de sequenciação de 2ª geração (Next-Generation).
Diferença entre mutação e polimorfismo:
As mutações são mais raras (menos de 1% na população) e os polimorfismos são superiores a 1%. Um alelo é considerado um polimorfismo se conferir uma vantagem positiva em relação a alguma população. Mas dependendo da zona, um alelo pode ser considerado uma mutação ou polimorfismo. Um exemplo é a anemia falciforme, que na Europa é considerado uma mutação mas na África é um polimorfismo por conferir vantagem em relação a resistência por infeção a malária.
Em biologia molecular podem ser feito dois tipos de analise:
* A genotipagem de mutações procura:
* Rastreio por detecção de alteração da expressão genética:
- variações raras nas sequencias de DNA e RNA (essencialmente um diagnostico de algo especifico)
- a variação do numero de copias de um gene (procura de algo que não se sabe bem o que e)
Boas praticas no laboratorio quando se lida com amostras clinicas:
- Usar luvas, mascara, óculos e bata caso a amostra esteja contaminada (com patogênicos tipo os vírus, por exemplo)
- Descontaminar a bancada com lixivia 10%
- Lixo biológico deve ser posto em contentores apropriados
- Muito cuidado a lidar com RNA, com luvas sempre
O que deve conter a identificação da amostra?
- Nome do paciente, data de nascimento e historico hospital
- nome do clinico responsável
- tipo de amostra biológica
- código de procedimento laboratorial
- dia e hora da colheita e o nome do técnico que a realizou
- teste requerido
As amostras de sangue devem ser conservadas com anticoagulantes. Por exemplo:
- EDTA que sequestra ioes de cálcio, um cofator importante para a cascata de coagulação; ideal para testes biológicos moleculares
- Heparina apenas usadas em citogenica porque inibe a DNA polimerase e, consequentemente, o PCR
Porque e que as amostras de sangue e medula não devem ser congeladas?
Para evitar a lise dos eritrócitos - a hemoglobina é um forte inibidor do PCR
A que única temperatura é que se pode conservar RNA?
-80ºC e por isso é sempre preciso centrifugar (a baixa rotações) primeiro as amostras para retirar os eritrócitos
A que temperatura se devem conservar amostras de fluidos biológicos com o fim de extração de DNA?
Entre 2 - 8 ºC para menos de 72 horas. A -20ºC e -80º não é recomendado
O que é o RNA latter e em que condições pode ser utilizado?
RNA latter estabiliza a molécula de RNA e com a sua utilização não é necessário separar dos eritrócitos e pode ser conservado até 12 dias em 18-25ºC e até 14 dias em 2-8º.
Transporte típico para amostras biológicas possivelmente contaminadas por microorganismos:
Contentor adequado, empacotamento com material absorvente, selagem em sacos de plástico e sempre marcado como material biológico potencialmente perigoso.
É aconselhável fixar os tecidos em:
Parafina (formalina ou paraformaldeido) - tecidos fixados podem ser usados para extração de RNA e DNA, removendo a parafina com etanol, por exemplo, seguido de lavagens, lise celular e depois extração
Fixação de tecidos em parafina é utilizada para:
Diagnose genética, doenças infeciosas e testes de identidade
Vantagens de extração automática de DNA:
- menos erros
- extrair mais amostras (12-96 em simultâneo) com maiores volumes (200ul - 10 ml)
- método padronizado
Passos fundamentais para separação de células mononucleadas para cultura:
- Separar glóbulos vermelhos dos brancos - 15 min a 1800 rpm
- Plasma fica no topo
- Tampão no meio com os glóbulos brancos
- Separação dos glóbulos brancos por adição de ficol seguida de centrifugações
- Ressuspender os glóbulos brancos em PBS e adicionar o meio RPMI - separação dos monócitos (aderem a placa) dos linfócitos (ficam em suspensão)
Passos fundamentais para a extração de DNA:
- Separar glóbulos brancos dos vermelhos
- Lise dos glóbulos brancos ou noutras células nucleadas
- Desnaturar/digerir proteínas
- Separar contaminantes (proteínas, heme) do DNA
- Precipitação do DNA
- Ressuspensao
O RNA deve ser armazenado com agua tratada com DEPC a -80ºC porque:
O DEPC é uma das poucas moléculas que consegue levar à desnaturação das RNAses, sendo um forte agente desnaturante. Deve ser lavado por autoclavagem
Passos fundamentais para isolamento de RNA:
- Separação dos glóbulos brancos
- Lise das células (evitando RNAses; agentes desnaturantes de proteínas)
- Separação das proteínas, DNA e outros detritos celulares
- Precipitação do RNA
- Ressuspender em agua com DEPC
A grande diferença entre a extraçao de DNA e RNA esta no ____.
pH - devido a desnaturação que ocorre se usar outro pH; na extração de RNA este deve ser de 6 e na de DNA deve ser de 8.
O que faz o isotiocianato de guanidina e qual a vantagem e desvantagem deste método:
Desnatura proteínas (agente caotropico), mantendo a integridade dos ácidos nucleicos. A vantagem é que é mais rápido e a desvantagem é que é necessária uma hotte e contentores de lixo toxico.
A concentração e qualidade dos ácidos nucleicos sao analisados no:
Espectrofotômetro
Para ver se o RNA esta contaminado com DNA e vice versa deve fazer-se:
- Correr em gel de agarose - neste se houver DNA genomico, fica uma banda intensa no inicio do gel (de grande peso molecular) e deve revelar bandas correspondentes a RNA 28S e 18S numa relação de 2:1 (se a banda de 18S for mais intensa que a de 28S ou se houver arrastamento de ambas o RNA esta degradado)
- Analisar parametro RIN que deve estar entre 7-8
Quando uma mutação altera o aminoácido produzido, pode ter ou não impacto na função da proteína, dependendo da localização:
Se for parte do centro ativo quase de certeza que terá grande impacto, mas se for parte de uma das extremidades pode não ser relevante.
Quando a mutação implica a existência de um codão de STOP prematuro a consequência, mais uma vez, depende da localização:
Se for a meio ou perto do início da sequência codificante quase de certeza que a proteína formada não é funcional; se for perto do fim da sequência pode não afetar a funcionalidade da proteína.
As inserções e deleções afetam a:
Grelha de leitura → proteína produzida será completamente diferente da suposta e estes casos são, geralmente, graves
Que regiões de repetições de sequências não codificantes possui o nosso genoma:
- Micro satélites - repetições de 2-3 nucleotídeos em tandem
- Mini satélites - repetições de 10-100 nucleotídeos em tandem
- Satélites: repetições de grandes sequencias espalhadas pelo genoma
Qual a utilidade das regiões de repetição das sequencias não codificantes no diagnostico molecular?
Discriminação pessoal - Testes de paternidade
O aumento do numero de repetições CAG no genoma esta associado a que doença?
Doença de Hungtinton
Em que se baseia o PCR?
Capacidade das DNA Polimerases para replicar o DNA e aumentar a amostra disponível para posterior análise (por sequenciação, por exemplo). A taxa de incorporação de dNTPs é cerca de 1000/min, mas vai diminuindo ao longo dos ciclos.
O Multiplex PCR permite:
Amplificar diferentes regiões de um gene em simultâneo → utilização de vários primers.
Em que consiste PCR-RFLP?
Baseada na utilização de enzimas de restrição específicas de sequência (endonucleases do tipo I) – hidrólise de DNA. Por estas enzimas serem específicas de sequência, se ocorre uma mutação no local de corte de uma enzima esta deixa de o reconhecer e deixa de catalisar a reação de hidrólise e
vice-versa. Depois há a separação dos fragmentos por eletroforese.
Em que consiste PCR-RFLP?
Baseada na utilização de enzimas de restrição específicas de sequência (endonucleases do tipo I) – hidrólise de DNA. Por estas enzimas serem específicas de sequência, se ocorre uma mutação no local de corte de uma enzima esta deixa de o reconhecer e deixa de catalisar a reação de hidrólise e vice-versa.
O PCR-RFLP e um método adequado para:
Genes com baixo número de mutações conhecidas.
Em que se baseia a técnica PCR ASO
Baseia-se no uso de oligonucleótidos específicos de alelos, o normal e o mutado, como primers e analisa se há ou não amplificação da amostra com cada par de primers.
No PCR-ASO, as diferenças entre os primers são pequenas (geralmente só um nucleotídeo). Como se garante a especificidade?
Condições foram otimizadas para que a cinética da amplificação apenas permitisse a hibridação com alta especificidade. Por exemplo, uma temperatura maior de annealing
Em que se baseia a técnica PCR-ARMS:
Usa, para além dos primers complementares aos alelos normais e mutados (P3 e P4, respetivamente), primers externos que ladeiam a zona afetada (P1 e P2), sendo mais específico. Posteriormente realiza-se uma eletroforese.
Como interpretar os resultados obtidos por PCR-ARMS?
- P1 + P2 + P3 = mutação
- P1 + P2 + P4 = normal (wt)
- P1 + P2 + P3 + P4 = heterozigótico
Porque se usam 2 conjuntos de primers (internos e externos) no PCR Nested?
Para aumentar a especificidade e a quantidade de amplificado
O PCR-ARMS é utilizado, por exemplo, para a deteção da:
Alteração G20210A da protombina, presente em trombofilia (aumento da formação de coágulos no sangue)
Passos no RT-PCR nested:
a) extração de RNA (sangue periférico, medula óssea, etc)
b) síntese de cDNA (transcriptase reversa)
c) 1º PCR (pimers externos)
d) 2º PCR (primers internos)
e) análise no gel de agarose
Em que consiste a técnica LAMP?
Uso de 6 primers, o que aumenta a sensibilidade e especificidade. A amplificação ocorre sob condições isotérmicas (sempre à mesma temperatura), sendo que a enzima BSM (uma DNA Polimerase) consegue quebrar também as pontes de hidrogénio, permitindo a hibridação dos primers, e sintetizar a cadeia a uma temperatura ótima de 60 ºC.
Que enzimas são necessárias para a RPA?
- recombinase
- SSB (single-strand DNA-binding protein)
- strand-displacing polymerase
Passos da RPA:
- formação de um complexo recombinase-primer
- primers emparelham
- estabilização das cadeias pela SSB
- polimerização pela strand-displacing polimerase
Vantagem da RPA:
- Pode ser feita entre 37ºC e42ºC, não necessitando de termociclador.
- Pode ser feito com RNA (se houver uma RT que funciona a 37-42 ºC)
RCA é uma técnica utilizada para a amplificação de:
DNA circular
Qual a enzima utilizada no RCA e que tipo de produtos origina:
Super Phi que dá origem a fragmentos lineares de vários tamanhos (pode ter várias sequências repetidas num só fragmento)
