Técnicas de DNA recombinante + Aulas Práticas Flashcards

1
Q

3 benefícios das técnicas de DNA recombinante são:

A

-clonagem de genes
-estudo de doenças hereditárias
-produláo de proteínas/drogas/vacinas

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2
Q

Quais são as técnicas básicas para se formam um DNA recombinante?

A

-Clivagem de DNA utilizando enzimas de restrição (nucleases)
-Ligação de fragmentos de DNA (ligases)
-Clonagem (p. ex. PCR)
-Hibridação para se encontrar uma sequência específica

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3
Q

As endonucleases reconhecem sequências específicas de … a … pares de bases

A

4 a 12

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4
Q

Quantos tipos de enzimas de restrição existem? Qual é usada em biologia molecular?

A

3 tipos, o tipo II

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5
Q

Porque é que se prefere utilizar as enzimas de restrição do tipo II, em vez das I ou III?

A

As enzimas I e III para além de serem dependentes de ATP, cortam de modo aleatório, e apenas têm a capacidade de metilar uma das cadeias de DNA. As tipo II são sistemas binários em que uma subunidade tem ação de corte e outra de metilação, sendo por isso as preferidas.

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6
Q

V ou F. As enzimas de restrição cortam o DNA normalmente em sequências palindrómicas.

A

Verdadeiro

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7
Q

As enzimas de restrição podem cortar o DNA formando 3 tipos de extremidades, quais?

A

-“Blunt ends”
-Extremidade coesiva 5’
-Extremidade coesiva 3’

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8
Q

V ou F. As sticky ends resultam do corte da enzima de restrição no meio da sequência palindrómica.

A

Falso, isso são as blunt ends

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9
Q

V ou F. O corte enzimático “blunt end” é preferível do que os coesivos. Justifique.

A

Falso, pois o blunt end é o corte exatamente a meio, não originando nenhuma cadeia simples o que dificulta a ligação com outra cadeia e diminui a ocorrência de erros

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10
Q

V ou F. Ao cortar com a mesma enzima de restrição DNAs de individuos diferentes, os cortes vão também ser diferentes para cada um

A

Falso

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11
Q

As bactérias utilizam as enzimas de restrição como defesa contra fagos, mas como é que não cortam o seu próprio DNA?

A

Enzimas de modificação (metilases), metilam o DNA bacteriano nos locais reconhecidos pela enzima de restrição o que impede a sua ação

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12
Q
A
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13
Q
A
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14
Q
A
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15
Q
A
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16
Q

Após o corte pelas enzimas de restrição realiza-se … de modo a separar os fragmentos cortados

A

Eletroferese em gel de agarose

16
Q

Se os fragmentos de DNA são maiores, devemos ter uma maior/menor concentração de agarose?

A

Menor

16
Q

V ou F. Quanto maior a concentração de agarose, melhor se vêm os segmentos mais pequenos de DNA

A

Verdadeiro

16
Q

Na aula de digestão de DNA com enzimas de restrição foi utilizado um cromóforo, qual e para que serve?

A

SulfisSafeGreen, é um agente intercalante que se liga ao DNA e reflete radiação UV conferindo-lhe fluorescência

17
Q

V ou F. Para fragmentos de DNA muito grandes devem se utilizar altas concentrações de agarose

A

Falso

18
Q

Como se define uma unidade de enzima de restrição?

A

A quantidade de enzima necessária para a digestão completa de 1micrograma de DNA durante 1h.

19
Q

Na aula de digestão de DNA com enzimas de restrição foi usado um gele 1% de agarose, porquê?

A

Pois concentrações mais baixas

20
Q

O que é um mapa de restrição?

A

Arranjo linear dos locais de DNA cortado com diferentes enzimas de restrição

21
Q

V ou F. A separação eletroforética de pequenas moléculas envolve a técnica de Pulse Field Eletrophoresis

A

Falso, grandes moléculas

22
Q

Na aula de digestão de DNA com enzimas de restrição, cortou-se o DNA com que enzimas?

A

EcoRI e HindIII

23
Q

Diga 3 características que deve apresentar um vetor de clonagem.

A

-Capacidade de incorporar DNA exógeno
-Replicação autónoma (ORI)
-Existência de locais únicos de corte por enzimas de restrição
-Fácil purificação

24
Q

Diga 3 exemplos de vetores de clonagem.

A

-Plasmídeos (pBR322)
-Fagos
-YACS,BACS, PACs (cromossomas artificiais de leveduras)

25
Q

O que é um polylinker?

A

Sequência sintética com vários locais diferentes reconhecidos por enzimas de restrição que não se encontram em mais nenhum local do plasmídeo

26
Q

V ou F. A versatilidade dos plasmídeos é aumentada com a inclusão de um polylinker.

A

Verdadeiro

27
Q

O vetor pBluescript possui dois tipos de promotores com orientações diferentes:

A

-T3 e T7

28
Q

Quais são os passos necessários para transformação de DNA?

A

-Tratamento com cloreto de cálcio (ligeiramenrte hipotónico - abre a membrana ligeiramente)
-Tratamento com iões positivos
-Choque térmico

29
Q

Na transformação como se supera o facto de o DNA ter carga negativa e as bactérias carga negativa também?

A

Misturamos as bactérias com iões positivos para esta ganhar afinidade ao DNA

30
Q

Na transformação porque se faz choque térmico?

A

Destabilização das membranas bacterianas e o DNA poder entrar

31
Q
A