Técnicas de DNA recombinante + Aulas Práticas

Question 1

3 benefícios das técnicas de DNA recombinante são:

Answer 1

-clonagem de genes
-estudo de doenças hereditárias
-produláo de proteínas/drogas/vacinas

Question 2

Quais são as técnicas básicas para se formam um DNA recombinante?

Answer 2

-Clivagem de DNA utilizando enzimas de restrição (nucleases)
-Ligação de fragmentos de DNA (ligases)
-Clonagem (p. ex. PCR)
-Hibridação para se encontrar uma sequência específica
…

Question 3

As endonucleases reconhecem sequências específicas de … a … pares de bases

Answer 3

4 a 12

Question 4

Quantos tipos de enzimas de restrição existem? Qual é usada em biologia molecular?

Answer 4

3 tipos, o tipo II

Question 5

Porque é que se prefere utilizar as enzimas de restrição do tipo II, em vez das I ou III?

Answer 5

As enzimas I e III para além de serem dependentes de ATP, cortam de modo aleatório, e apenas têm a capacidade de metilar uma das cadeias de DNA. As tipo II são sistemas binários em que uma subunidade tem ação de corte e outra de metilação, sendo por isso as preferidas.

Question 6

V ou F. As enzimas de restrição cortam o DNA normalmente em sequências palindrómicas.

Answer 6

Verdadeiro

Question 7

As enzimas de restrição podem cortar o DNA formando 3 tipos de extremidades, quais?

Answer 7

-“Blunt ends”
-Extremidade coesiva 5’
-Extremidade coesiva 3’

Question 8

V ou F. As sticky ends resultam do corte da enzima de restrição no meio da sequência palindrómica.

Answer 8

Falso, isso são as blunt ends

Question 9

V ou F. O corte enzimático “blunt end” é preferível do que os coesivos. Justifique.

Answer 9

Falso, pois o blunt end é o corte exatamente a meio, não originando nenhuma cadeia simples o que dificulta a ligação com outra cadeia e diminui a ocorrência de erros

Question 10

V ou F. Ao cortar com a mesma enzima de restrição DNAs de individuos diferentes, os cortes vão também ser diferentes para cada um

Answer 10

Falso

Question 11

As bactérias utilizam as enzimas de restrição como defesa contra fagos, mas como é que não cortam o seu próprio DNA?

Answer 11

Enzimas de modificação (metilases), metilam o DNA bacteriano nos locais reconhecidos pela enzima de restrição o que impede a sua ação

Question 16

Após o corte pelas enzimas de restrição realiza-se … de modo a separar os fragmentos cortados

Answer 16

Eletroferese em gel de agarose

Question 16

Se os fragmentos de DNA são maiores, devemos ter uma maior/menor concentração de agarose?

Answer 16

Menor

Question 16

V ou F. Quanto maior a concentração de agarose, melhor se vêm os segmentos mais pequenos de DNA

Answer 16

Verdadeiro

Question 16

Na aula de digestão de DNA com enzimas de restrição foi utilizado um cromóforo, qual e para que serve?

Answer 16

SulfisSafeGreen, é um agente intercalante que se liga ao DNA e reflete radiação UV conferindo-lhe fluorescência

Question 17

V ou F. Para fragmentos de DNA muito grandes devem se utilizar altas concentrações de agarose

Answer 17

Falso

Question 18

Como se define uma unidade de enzima de restrição?

Answer 18

A quantidade de enzima necessária para a digestão completa de 1micrograma de DNA durante 1h.

Question 19

Na aula de digestão de DNA com enzimas de restrição foi usado um gele 1% de agarose, porquê?

Answer 19

Pois concentrações mais baixas

Question 20

O que é um mapa de restrição?

Answer 20

Arranjo linear dos locais de DNA cortado com diferentes enzimas de restrição

Question 21

V ou F. A separação eletroforética de pequenas moléculas envolve a técnica de Pulse Field Eletrophoresis

Answer 21

Falso, grandes moléculas

Question 22

Na aula de digestão de DNA com enzimas de restrição, cortou-se o DNA com que enzimas?

Answer 22

EcoRI e HindIII

Question 23

Diga 3 características que deve apresentar um vetor de clonagem.

Answer 23

-Capacidade de incorporar DNA exógeno
-Replicação autónoma (ORI)
-Existência de locais únicos de corte por enzimas de restrição
-Fácil purificação

Question 24

Diga 3 exemplos de vetores de clonagem.

Answer 24

-Plasmídeos (pBR322)
-Fagos
-YACS,BACS, PACs (cromossomas artificiais de leveduras)

Question 25

O que é um polylinker?

Answer 25

Sequência sintética com vários locais diferentes reconhecidos por enzimas de restrição que não se encontram em mais nenhum local do plasmídeo

Question 26

V ou F. A versatilidade dos plasmídeos é aumentada com a inclusão de um polylinker.

Answer 26

Verdadeiro

Question 27

O vetor pBluescript possui dois tipos de promotores com orientações diferentes:

Answer 27

-T3 e T7

Question 28

Quais são os passos necessários para transformação de DNA?

Answer 28

-Tratamento com cloreto de cálcio (ligeiramenrte hipotónico - abre a membrana ligeiramente)
-Tratamento com iões positivos
-Choque térmico

Question 29

Na transformação como se supera o facto de o DNA ter carga negativa e as bactérias carga negativa também?

Answer 29

Misturamos as bactérias com iões positivos para esta ganhar afinidade ao DNA

Question 30

Na transformação porque se faz choque térmico?

Answer 30

Destabilização das membranas bacterianas e o DNA poder entrar