Técnicas de DNA recombinante + Aulas Práticas Flashcards
3 benefícios das técnicas de DNA recombinante são:
-clonagem de genes
-estudo de doenças hereditárias
-produláo de proteínas/drogas/vacinas
Quais são as técnicas básicas para se formam um DNA recombinante?
-Clivagem de DNA utilizando enzimas de restrição (nucleases)
-Ligação de fragmentos de DNA (ligases)
-Clonagem (p. ex. PCR)
-Hibridação para se encontrar uma sequência específica
…
As endonucleases reconhecem sequências específicas de … a … pares de bases
4 a 12
Quantos tipos de enzimas de restrição existem? Qual é usada em biologia molecular?
3 tipos, o tipo II
Porque é que se prefere utilizar as enzimas de restrição do tipo II, em vez das I ou III?
As enzimas I e III para além de serem dependentes de ATP, cortam de modo aleatório, e apenas têm a capacidade de metilar uma das cadeias de DNA. As tipo II são sistemas binários em que uma subunidade tem ação de corte e outra de metilação, sendo por isso as preferidas.
V ou F. As enzimas de restrição cortam o DNA normalmente em sequências palindrómicas.
Verdadeiro
As enzimas de restrição podem cortar o DNA formando 3 tipos de extremidades, quais?
-“Blunt ends”
-Extremidade coesiva 5’
-Extremidade coesiva 3’
V ou F. As sticky ends resultam do corte da enzima de restrição no meio da sequência palindrómica.
Falso, isso são as blunt ends
V ou F. O corte enzimático “blunt end” é preferível do que os coesivos. Justifique.
Falso, pois o blunt end é o corte exatamente a meio, não originando nenhuma cadeia simples o que dificulta a ligação com outra cadeia e diminui a ocorrência de erros
V ou F. Ao cortar com a mesma enzima de restrição DNAs de individuos diferentes, os cortes vão também ser diferentes para cada um
Falso
As bactérias utilizam as enzimas de restrição como defesa contra fagos, mas como é que não cortam o seu próprio DNA?
Enzimas de modificação (metilases), metilam o DNA bacteriano nos locais reconhecidos pela enzima de restrição o que impede a sua ação
Após o corte pelas enzimas de restrição realiza-se … de modo a separar os fragmentos cortados
Eletroferese em gel de agarose
Se os fragmentos de DNA são maiores, devemos ter uma maior/menor concentração de agarose?
Menor
V ou F. Quanto maior a concentração de agarose, melhor se vêm os segmentos mais pequenos de DNA
Verdadeiro
Na aula de digestão de DNA com enzimas de restrição foi utilizado um cromóforo, qual e para que serve?
SulfisSafeGreen, é um agente intercalante que se liga ao DNA e reflete radiação UV conferindo-lhe fluorescência
V ou F. Para fragmentos de DNA muito grandes devem se utilizar altas concentrações de agarose
Falso
Como se define uma unidade de enzima de restrição?
A quantidade de enzima necessária para a digestão completa de 1micrograma de DNA durante 1h.
Na aula de digestão de DNA com enzimas de restrição foi usado um gele 1% de agarose, porquê?
Pois concentrações mais baixas
O que é um mapa de restrição?
Arranjo linear dos locais de DNA cortado com diferentes enzimas de restrição
V ou F. A separação eletroforética de pequenas moléculas envolve a técnica de Pulse Field Eletrophoresis
Falso, grandes moléculas
Na aula de digestão de DNA com enzimas de restrição, cortou-se o DNA com que enzimas?
EcoRI e HindIII
Diga 3 características que deve apresentar um vetor de clonagem.
-Capacidade de incorporar DNA exógeno
-Replicação autónoma (ORI)
-Existência de locais únicos de corte por enzimas de restrição
-Fácil purificação
Diga 3 exemplos de vetores de clonagem.
-Plasmídeos (pBR322)
-Fagos
-YACS,BACS, PACs (cromossomas artificiais de leveduras)
O que é um polylinker?
Sequência sintética com vários locais diferentes reconhecidos por enzimas de restrição que não se encontram em mais nenhum local do plasmídeo
V ou F. A versatilidade dos plasmídeos é aumentada com a inclusão de um polylinker.
Verdadeiro
O vetor pBluescript possui dois tipos de promotores com orientações diferentes:
-T3 e T7
Quais são os passos necessários para transformação de DNA?
-Tratamento com cloreto de cálcio (ligeiramenrte hipotónico - abre a membrana ligeiramente)
-Tratamento com iões positivos
-Choque térmico
Na transformação como se supera o facto de o DNA ter carga negativa e as bactérias carga negativa também?
Misturamos as bactérias com iões positivos para esta ganhar afinidade ao DNA
Na transformação porque se faz choque térmico?
Destabilização das membranas bacterianas e o DNA poder entrar
