Técnicas de Citogenômica

Question 1

Técnicas possíveis em ordem de aumento da resolução:

Answer 1

Cariótipo convencional > cariótipo com bandamento > bandamento de alta resolução (esticar o cromossomo ao máximo) > CGH array (hibridização genômica comparativa) > FISH (fluorescent in situ hybridization) > microarranjos cromossômicos (array por SNP ou por beads) > sequenciamento (sanger/nova geração)

Question 2

Qual o material, o tipo celular e a técnica utilizados para cultura de DNA?

Answer 2

• Utiliza-se o sangue (mais especificamente os linfócitos T) - outros: bx de pele para cultura de fibroblastos
• São colocados em meio com fatores de crescimento e parados na metáfase por reagentes químicos inibidores de fuso mitótico.
• As células são tratadas em meio hipotônico para se romperem e liberarem o DNA
• A cultura simples para cariótipo é de curta duração (3-4 dias), se a intenção for de guardar o material por longos períodos de tempo deverá ser realizada cultura estendida (pode ser estimulada a diferenciação em linfoblastos potencialmente imortais).
• A obtenção de material para sequenciamento (ex. genoma) pode vir de qualquer tecido com DNA viável e as células não precisam estar em divisão.

Question 3

Hibridização in situ por fluorescência (FISH): qual o princípio da técnica?

Answer 3

• Sondas de DNA específicas (complementares a sequências alvo) para regiões em estágio de metáfase ou intérfase são marcadas com fluorocromos de anticorpos para identificar rearranjos cromossômicos ou diagnosticar rapidamente a existência de número cromossômico anormal no material clínico.
• NÃO vê bem alterações de tamanho muito pequeno (exceto se utilizar sondas locus específicas - raramente), é uma técnica de alto custo, principalmente porque nem sempre há sondas comerciais e a construção de sondas específicas (BACs ou YACs - cromossomos artificiais de bactérias e leveduras) é de alto custo.

Question 4

CGH array: princípios da técnica

Answer 4

• Varredura de variantes de número de cópias em todo o genoma com base em análise comparativa (paciente x controle) de muitas regiões hibridadas.
• As regiões hibridadas são lidas por fluorescência e a análise consiste em uma razão da fluorescência de cada região do paciente versus a do controle.
• A resolução do array depende do distanciamento entre as sondas, de forma que ao aumentar a densidade de sondas aumentamos a cobertura.
• NÃO enxerga rearranjos e translocações (mostra que há cópias há mais ou há menos, porém não diz onde estão).

Question 5

Northern Blotting: para que serve?

Answer 5

Definição do perfil de expressão e splicing alternativo de RNA

Question 6

Northern Blotting: técnica

Answer 6

Obtenção do RNA total ou mensageiro -> separação eletroforética em condições desnaturantes (carga iônica e peso molecular) -> transferência para membrana de nailon é etapa-cheve (fixação em matriz sólida) -> hibridação em sondas marcadas com fluorótopos -> deteção do sinal de hibridação -> detecção do grau de expressão gênica (pela densidade óptica)

Obs.: atentar para não contaminação com RNAses (principalmente da ponta dos dedos) e uso de inibidores de RNAses

Question 7

Ensaio de Proteção à Ribonuclease: para que serve?

Answer 7

Análise de RNAm e expressão gênica

Question 8

Ensaio de Proteção à Ribonuclease: técnica

Answer 8

• Diferentemente do Northern blotting, no qual a hibridação é realizada com o RNA adsorvido a uma membrana, no RPA a hibridação é feita em solução, utilizando‐se uma sonda de RNA complementar à sequência do mRNA que se quer estudar -> mRNA‐alvo.
• O produto da hibridação é submetido a um tratamento com RNases, que digerem apenas fitas simples de RNA. Assim, os transcritos de mRNA‐alvo que se hibridaram à sonda e formaram RNA dupla‐fita são protegidos da digestão, enquanto todos os mRNAs que não se ligaram à sonda e o excesso de sonda (fitas simples) são destruídos pelas RNases.
• Os fragmentos dupla‐fita são separados eletroforeticamente e são expostos a um filme radiográfico para que o sinal da sonda marcada possa ser mensurado.

Question 9

Reação em cadeia de polimerase (PCR): técnica

Answer 9

Amplificação enzimática de sequências de DNA (alvo) dirigida por iniciadores oligonucleotídeos (primers) que resulta na geração de um número exponencial de cópias (leituras) dessas sequências.

1) Desnatura (temperatura)
2) Hibrida iniciadores nos alvos de fita simples
3) Síntese de nova cadeia de DNA com DNA polimerase unindo DNA-alvo + iniciador (primer)

4) Várias técnicas são empregadas para avaliar o produto amplificado, incluindo eletroforese
(+ comum), digestão enzimática (endonucleases), blotting, emissão de fluorescência, sequenciamento, espectrometria de massa e outras.

Obs.: RT-PCR: amplificação a partir de RNA, o transformando em cDNA para amplificação