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MMD1042 _ EXAM 3 _ Alex > Technologies de l'ADN > Flashcards

Technologies de l'ADN Flashcards

Professeur: Dr Labbé

1
Q

Que sont les nucléases?

A

Une nucléase est une enzyme qui clive les liaisons phosphodiester de brins acides nucléiques entre deux nucléotides

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Q

Qu’est-ce qu’une exonucléase?

A

Coupe les acides nucléiques (ADN ou ARN) à partir d’une extrémité, un nucléotide à la fois, et dans un sens 5’ -> 3’ ou dans le sens 3’ -> 5’

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3
Q

Qu’est-ce qu’une endonucléase?

A

Une enzyme qui coupe au milieu de la chaîne d’acide nucléique, produisant des fragments

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4
Q

Qu’est-ce les endonucléases de restriction?

A

Coupent l’ADN bicaténaire à des endroits caractérisés par des séquence de nucléotides spécifiques, dites Sites de Restrictions

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5
Q

Selon quoi sont nommés les enzymes de restrictions? et ils servent à quoi?

A

Selon l’espèce de bactérie desquelles on été isolé

Servent à la défense contre les virus des bactéries
(les bactériophages) en coupant l’ADN étranger en morceaux

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6
Q

Les enzymes de restriction font partie d’un
système de _________ de bactéries

A

défense

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7
Q

c’Est quoi des enzyme de restriction? Quelles séquences reconnaissent les enzymes de restrictions? et que fait cette séquence?

A

Ce sont des enzymes qui reconnaissent et coupent l’ADN à
des séquences spécifiques produisant des fragments d’ADN

séquences palindromiques

Une séquence palindromique se lit de la
même façon dans les deux directions
5’GAATTC3’
3’CTTAAG5’

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8
Q

Que résulte du clivage via HaeIII?

A

Bouts francs

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9
Q

Que résulte du clivage via EcoRI?

A

Bouts collants

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10
Q

Que résulte du clivage via HindIII?

A

Bouts collants

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11
Q

Est-ce que les enzymes de restrictions sont spécifiques à une seule séquence?

A

OUI

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12
Q

Pourquoi les enzymes de restrictions sont si importantes pour nous?

A

Caractère prédictif

À la fin des années 70 les enzymes de
restriction ont été le premier outil en Biologie
Moléculaire pour caractériser des gènes et
l’ADN en général

On a commencé à faire des cartographiés
de restriction des ADN isolés
d’organismes et des virus

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13
Q

Que peut-on faire de très très rudimentaire avec les enzymes de restrictions?

A

Cartographies par restriction

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14
Q

Une fois coupés, les fragments d’ADN peuvent être séparés selon la taille par…

A

Électrophorèse sur Gel d’Agarose

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15
Q

Explique le principe d’Électrophorèse sur Gel d’Agarose.

A

ADN est -
pour faire une analyse de restriction, une fois coupé, on met les fragments d’ADN dans un gel d’agarose et on active un courant électrique
ADN migre vers le + à différentes vitesses selon la taille (gros = lents)

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16
Q

Comment est-ce qu’on détecte les fragments d’ADN à la suite de l’électrophorèse?

A

Bromure d’Ethidium
(=agent intercalant)
+ UV

*Électrophorèse sur gel d’agarose : Les fragments d’ADN migrent dans le gel sous un courant électrique. Les petits fragments avancent plus loin que les gros.

Détection avec bromure d’éthidium (EtBr) + UV : Le bromure d’éthidium s’intercale entre les bases de l’ADN et devient fluorescent sous UV, rendant les fragments visibles sous forme de bandes blanche.

Alternative (32P) : L’ADN peut aussi être marqué radioactivement, les fragments apparaissent alors sous forme de bandes noires sur un film photographique*.

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17
Q

Après électrophorèses, que peut-on déduire de nos résultats?

A

La position des sites de restrictions sur le bout d’ADN à l’étude

les résultats de l’électrophorèse révèlent où les enzymes de restriction ont coupé l’ADN

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18
Q

Comment peut-on joindre deux fragments d’ADN ensemble?

A

Ligase

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19
Q

Nomme les deux types de liaisons de la ligation.

A

Ligation d’extrémités cohésives
Ligation d’extrémités franches

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20
Q

Qu’est-ce que la ligation?

A

Création d’ADN recombinant au laboratoire en joignant n’importe quels (deux ou plus) fragments d’ADN

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21
Q

Est-ce que les deux bouts cohésifs doivent êtres compatibles?

A

OUI

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22
Q

Est-ce que la ligase demande de l’ATP?

A

OUI

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23
Q

L’efficacité de ligation de bouts francs est ____ fois plus faible que celle de la ligation de bouts collants

A

100

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24
Q

Pourquoi l’efficacité de ligation de bouts francs est plus faible que celle des bouts collants?

A

Car les bouts collants s’apparient donc stabilisent les interactions,
tandis que pour les bouts francs les contacts entre les deux fragments
d’ADN dépendent de collisions aléatoires

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25
Q

Qu’Est-ce qu’un plasmide?

A

Est un cercle d’ADN bicaténaire qui peut se répliquer de façon autonome dans un organisme hôte

En résumé : Un plasmide est un cercle d’ADN qui se copie de manière autonome grâce à une origine de réplication et à des gènes essentiels pour fonctionner dans l’hôte.

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26
Q

Qu’est-ce qui se retrouve dans un plasmide?

A
  • Origine de réplication fonctionnel
  • Gènes spécifiques qui codent pour des protéines nécessaires à sa réplication dans l’organisme hôte
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27
Q

Qu’est-ce qu’un vecteur?

A

Un vecteur est un plasmide, qui a été manipulé en laboratoire, dans lequel on peut insérer (cloner) des fragments d’ADN

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28
Q

Le vecteur est un plasmide contenant des séquences d’ADN requise pour…

A
  • Réplication dans bactérie (origine de réplication)
  • Gène de sélection (résistance aux antibiotiques), pour sélectionner spécifiquement les bactéries qui contiennnent le vecteur
  • Sites de restrictions pour insérer des fragments d’ADN
  • Site de multiclonage avec plusieurs dites de clonage en ligne pour faciliter le clonage de fragment d’ADN
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29
Q

Explique le clonage d’un fragment d’ADN.

A

Le clonage est, l’insertion d’un fragment d’ADN dans un vecteur

  1. Digestion du vecteur : On coupe le vecteur avec une enzyme de restriction (ex. Eco RI).
  2. Digestion du fragment d’ADN : Le fragment d’ADN à insérer est coupé aux mêmes sites avec la même enzyme de restriction (Eco RI) pour qu’il s’adapte au vecteur.
  3. Ligation : On colle le fragment d’ADN dans le vecteur à l’aide d’une ligase.
  4. Plasmide recombinant : Le plasmide contenant le nouvel ADN est prêt à être introduit dans une cellule hôte.
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30
Q

Est-ce que toutes les cellules vont accepter le plasmide recombinant?

A

L’efficacité de transformation n’est pas 100%
-à Pas toutes les cellules vont recevoir le plasmide

NON, environ 1/2000

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31
Q

Transformation est le procédé …

A

d’introduction d’un plasmide dans une
souche de bactérie ou de levure

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32
Q

Alors comment va-t-on identifier les cellules qui ont reçu le plasmide?

A

On utilise un marqueur de sélection sur le plasmide, comme un gène de résistance à un antibiotique (par exemple, la résistance à l’ampicilline) pour sélectionner les cellules (les clones) qui ont reçu le plasmide

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33
Q

Utilisations possible de l’ADN amplifié des bactéries?

A
  • Pour préparer une grande quantité de l’insert afin de séquencer l’insert (l’ADN inséré)
  • Pour poursuivre un autre clonage avec ce plasmide
  • Pour la production de protéines recombinantes (insuline)
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34
Q

À quoi servent les protéines recombinantes?

A

Production de protéines d’intérêt médical ou biothechologique

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35
Q

Explique l’utilisation d’un vecteur d’expression pour la production de protéines recombinantes thérapeutiques (Ex: l’insuline humaine).

A
  1. Promoteur bactérien (permettant l’initiation de la transcription)
  2. Clonage du gène (restriction, ligation)
  3. Transformation du plasmide d’expression dans des bactéries adéquates
  4. Surexpression et purification de la protéine produite en grandes quantités
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36
Q

À quoi servent les GFP (green fluorescent protein)?

A

permettent d’étudier l’en temps réel et in vivo
- Les niveaux de transcription d’un gène
- Les niveaux de traduction
- Localisation cellulaire de protéines
- Et co-localisation cellulaire

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37
Q

Que permettent les différents types de protéines fluorescentes?

A

permet la co-localisation de protéines et de structures cellulaire

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38
Q

Nomme les propriétés des ADN polymérases.

A
  • Polymérisation toujours dans la direction 5’ -> 3’
  • Ne peut pas initier la réplication à partir de rien
  • Peut seulement ajouter des nouveaux nucléotides à un bout 3’ OH déjà existant
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39
Q

Amorce in vivo donc dans la cellule?

A

amorce peut être un fragment d’ARN ou un fragment d’Okazaki

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40
Q

Amorce in vitro donc en lab?

A

Oligonucléotide (petite chaine d’ADN ou ARN), elle se fixe sur le bout 3’ du brin d’ADN en polymérisation

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41
Q

Matrice simple brin in vivo?

A

région simple brin de l’hélice ouverte par l’hélicase

42
Q

Matrice simple brin in vitro?

A

ADN simple brin obtenu par dénaturation thermique

43
Q

explique la Courbe de dénaturation de l’ADN et donne le Nom du point d’inflexion de la courbe de dénaturation de l’ADN?

A

quand on augmente la température, l’ADN passe de double brin à simple brin et l’absorbance à 260 nm (même effet avec augmentation ph).

Tm: Melting temperature

*Plus les brins se séparent, plus l’ADN absorbe la lumière à une longueur d’onde de 260 nm
*Le point d’inflexion sur la courbe correspond à la température de fusion (Tm).
À cette température, environ 50 % de l’ADN est dénaturé (séparé en simple brin).

44
Q

Pourquoi la Tm d’un chaine de PolyAT est plus basse qu’une chaine de PolyGC?

A

CG = 3 ponts H donc plus difficle à séparer, donc la dénaturation se produit à température plus élevées
TA = 2 ponts H donc plus facile à séparer, donc la dénaturation se produit à température plus bases

45
Q

Vrai ou faux? L’ADN dénaturé (simple brin) peut se renaturer (re-hybrider) en ADN double brin, lorsqu’on revient aux bonnes conditions (initiales)

A

Vrai

46
Q

Explique le principe de l’hybridation.

A
  1. Dénaturation de l’ADN via hautes températures
  2. ADN simple brins
  3. Renaturation si baisse de la température
  4. Hybridation de l’ADN et re-appariment des brins selon rè`gle G-C et A-T. reformant la double brin
47
Q

Explique la méthode de Sanger (méthode de terminaison de chaine) et à quoi elle sert.

A

Est un moyen pour détecter une mutation dans un gène, par exemple
Trouver l’ordre des bases (A, T, G, C) dans un brin d’ADN, c’est-à-dire séquencer l’ADN.

  1. Séparation des brins et ajout d’amorce
  2. Ajout: des amorces, des désoxynucléotides (dG, dA, dT, dC), un des dNTPs est marqué pour détection
  3. Ajout d’un des didéoxynucléotides (ddNTP) par tube et de l’ADN polymérase pour polymérisation de l’ADN
  4. Séparation sur gel et détection des brins synthétisées par extension de l’amorce
  5. Lecture de la séquence sur gel: En regardant où chaque fragment s’est arrêté, on peut reconstituer la séquence du brin d’ADN
48
Q

Grandeur et nature de l’amorce dans la méthode de terminaison de chaine?

A
  • 15 à 30 nucléotides
  • oligonucléotide complémentaire au brin d’ADN
  • radioactive ou fluorescente
  • La polymérase permet d’ajouter des dNTP et à polymériser l’ADN en 3’ de l’amorce
49
Q

Que nous permet de lire la méthode de terminaison de chaine et pourquoi?

A

Puisqu’on aura à la fin la longueur de chaque brin d’ADN finissant par A, C, T ou G, on pourra en déduire la séquence du brin à l’étude

50
Q

Sur quoi se base la méthode de Sanger?

A

Sur l’ajout dans l’ADN recopié de ddNTP, un dNTP modifié qui ne possède pas de OH sur l’extrémité 3’ et qui, par conséquent, termine la polymérisation de son brin d’ADN

51
Q

Explique le cycle du PCR.

A

1) Séparation des brins (95oC)
2) Hybridation des amorces (55oC)
3) Synthèse par la TaqI ADN polymérase (72oC)

btw La PCR (Polymerase Chain Reaction) est une technique qui permet de faire plein de copies d’un fragment d’ADN. L’utilité principale est d’amplifier une toute petite quantité d’ADN pour pouvoir l’analyser

52
Q

Localisation de la Taql ADN polymérase?

A

provient de la bactérie Thermus aquaticus qui vit à 70 degré, elle est donc pas dénaturé par la chaleur

53
Q

Combien de cycle de PCR?

A

20-30 d’environ 5 min chacun

54
Q

Plus les amorces sont longues…

A

plus elles sont spécifiques et moins de chance de se fixer au mauvais endroit

Si l’amorce est trop courte, il y a plus de chance qu’elle trouve un endroit similaire à plusieurs endroits du génome.

55
Q

Taille suggéré d’amorce pour PCR?

A

15 à 30 nu

56
Q

Nomme les deux sortes de séquences répétées en tandem junk.

A

STR
VNTR

57
Q

Combien de fois un STR peut être répété dans un locus? et combien de nu

A

5 à 200 fois
2 à 6 nu

58
Q

Est-ce que le nb de répétition de STR/VSTR varie entre les individus, pour un même locus? combien le génome humain a de di-nucléotide?

A

OUI
50k à 100k di-nucléotide répété

59
Q

Que permet les STR?

A

DNA fingerprinting

60
Q

Combien de fois le VNTR peut être répété dans un même locus? combien de nu

A

10 à 1,500
10 à 100 nu

61
Q

Décrit la méthode pour les tests de paternité.

A

Analyse des copies de la mère et du père par électrophorèse et comparaison avec celui du bébé (toutes les bandes du bébé doivent correspondre aux bandes de la maman ou du papa)

Si les deux copies du VNTR et/ou STR n’ont pas le même nombre
de séquences, répétées on voit deux bandes

62
Q

Plus le STR ou VNTR testé est _______, plus il est utile dans ce test de profil génétique.

En raison des nombreux _____, chaque personne a un
____ qui peut être distingué de l’ADN des autres individus

A

polymorphique cad (nombre de
séquences répétées très
variable selon les individus)

polymorphismes
ADN

63
Q

Que sont les SNPs?

A

Polymorphismes d’un seul nucléotide (différence d’une seule base dans l’ADN)

représentent 90% des variations génétiques humaines

Les sites dans la séquence d’ADN où les individus
diffèrent selon une seule base d’ADN sont appelés
Polymorphismes de nucléotides simples (SNP)

64
Q

La séquence d’ADN de __ personnes choisies au hasard est identique à _

Le _ restant ce sont des variations qui caractérisent chaque individu génétiquement

Les _, cependant, peuvent fortement affecter le risque de _

A

2, 99,9%

0,1%

variation, risque de maladie

65
Q

Combien de SNPs par personne?

A

1/300 nucléotides
donc environ 10 Millions de SNP/ génnome humain de 3 milliard de nucléotide

66
Q

Que crée les SNPs pour une personne?

A

Ensemble les SNPs créent un motif d’ADN
unique pour cette personne

67
Q

Les SNP aide à quoi?

A

Les SNPs aideront à améliorer
considérablement notre capacité à
comprendre et à traiter les maladies humaines

68
Q

Est-ce que les SNPs sont des cas aléatoires?

A

Non, c’est une variante dans la population et non pas un cas aléatoire(ex: cheveux plats)

C’est une variation trouvée plus grande que 1% de la population

69
Q

Qu’est-ce qu’une mutation?

A

Changement de base qui touche mois de 1% de la population (moins commun que les SNPs)

70
Q

Les SNPs peuvent être associés à différents ______________.

A

traits génétiques: couelru yeux, performance musculaire, comportement social, hérédité et susceptibilité à des maaldie, réponse à des meds

Ces petites différences de nucléotides peuvent faire une grande
différence: Peuvent déterminer que nous soyons petit ou grand, la
couleur de la peau et des cheveux

71
Q

Qu’amène de néfaste les SNPs?

A

Certaines maladies et cancer (ex: fibrose kystique)

Ça peut déterminer les probabilités d’avoir un cancer or pas. Des
femmes portant une variation génétique dans le gène BRCA-1 sont
7X plus susceptibles d’être atteintes d’un cancer de sein

– Si on manque trois nucléotides (CTT) à un site spécifique on
pourrait être atteint de Fibrose Kystique si on est homozygote
pour cet allèle

72
Q

SNPs causatifs

A

Causent un trait génétique, une maladie, une susceptibilité, une différence de réponse à un traitement

73
Q

SNPs liés

A

Sont à proximité d’un gène causant un trait génétique, une maladie, une susceptibilité, une différence de réponse à un traitement. Ils ne causent pas de traits mais servent de marqueurs

74
Q

SNPs des régions codantes

A

Peuvent affecter la séquence et la fonction des protéines

75
Q

SNPs des régions non-codantes

A

Peuvent affecter l’épissage de pré-ARNm, la régulation d’un gène, niveau d‘expression

76
Q

Qu’est-ce que le projet HapMap?

A

Identification des suceptibilités génétiques à des maladies

but de réduire le nb de SNP requis pour examiner l’ensemble du génome pour l’association avec un phénotype (maladie, sensibilité…)

réduire de 10 million de snp à 500k.

donc étude du génome plus efficace et complète pour trouver région qui affectent les maladie.

77
Q

Décrit les objectifs du projet HapMap.

A
  • Identifier de différences génétiques dans la population qui permettront de prédire la susceptibilité à des maladies
  • Développer de tests génétiques pour prédire si un individu développera une maladie particulaire
  • Offrir un traitement individualisé pour prévenir ou délayer le commencement de la maladie
78
Q

Explique la médecine personnalisée.

A

L’utilisation d’analyses moléculaires pour aider les médecins dans le choix du traitement de la maladie d’un patient pour qu’il soit le plus efficace dans le contexte du profile génétique et environnemental du patient

besoin de la développer pcq des gens réagissent mal au med ou meurt ou effet secondaire.

79
Q

Quelle est la caractéristique la plus saillante des enzymes de restriction?

A

Ce sont des enzymes qui reconnaissent et coupent l’ADN à des séquences spécifiques (sites de restriction)
Prédictibles

80
Q

Sur un gel d’agarose, vers quel pôle migrent les fragments d’ADN?

A

+ (car ADN chargé -)

81
Q

Que fait-on pour visualiser les fragments d’ADN sur un gel d’agarose?

A

Bromure d’Ethidium + UV

82
Q

Peut-on liguer un fragment d’ADN ayant des bouts collants avec un autre fragment d’ADN ayant des bouts francs?

A

NONNNNNNN

83
Q

Quels sont les éléments importants d’un vecteur général de clonage, et en particulier d’un vecteur d’expression?

A
  • Origine de réplication
  • Résistance aux antibiotiques
  • Sites de restrictions
  • Sites de multiclonages
84
Q

Quelles sont les composantes essentielles d’une réaction de polymérisation de l’ADN in vitro?

A
  • Amorce: Oligonucléotide ADN ou ARN, 3’ du brin d’ADN en polymérisation
  • Matrice simple brin: chaleur
  • Polymérase
85
Q

Comment on obtient de l’ADN simple brin in vitro?

A

Chaleur = dénaturation

86
Q

Quel composé provoque la terminaison de chaine dans la méthode de séquençage d’ADN de Sanger?

A

ddNTP

87
Q

Quelles sont les 3 étapes d’un cycle de réaction PCR?

A

1) Séparation des brins (95oC)
2) Hybridation des amorces (55oC)
3) Synthèse par la TaqI ADN polymérase (72oC)

88
Q

Dans une réaction de PCR, pourquoi faut-il chauffer à 95°C?

A

Pour dénaturer l’ADN et obtenir deux simples brins

89
Q

Dans une réaction de PCR, combien de molécules d’ADN on obtient, à partir d’une seule molécule d’ADN, après 10 cycles, 20 cycles, 30 cycles?

A

2^10
2^20
2^30

90
Q

Quelles sont les différences entre VNTR et STR?

A

STR: 2-6 nucléotides, 5-200 x
VNTR: 10-100 nucléotides, 10-1500 x

91
Q

Comment peut-on déterminer l’identité d’un individu en laboratoire en utilisant un échantillon contenant de l’ADN?

A

Électrophorèse sur gel des deux échantillons et comparaison

92
Q

Quelle est la différence entre SNP et mutation?

A

SNP: commune (toute plus de 1% de la pop)
Mutation: rares (moins de 1% de la pop)

93
Q

Quelle est l’utilité des SNP liés?

A

Médecine personnalisée

Marqueur genetique qui aident à détecter mutations, predire maladie, ou tracer histoire genetique

94
Q

Que permet de faire CRISPR?

A

Modifier de manière spécifique l’ADN

95
Q

Que font les bactéries avec CRISPR?

A

Protection contre les phages (virus), comme un système immunitaire.

96
Q

Que permet de faire CRISPR avec les bactéries?

A

Reconnaitre l’ADN étranger et de le détruire spécifiquement.

97
Q

Sur quoi repose le système CRISPR-Cas9?

A

Le système CRISPR-Cas9 repose sur l’assemblage d’une nucléase (l’enzyme Cas9) qui est guidée par un petit ARN vers un fragment d’ADN double brin spécifique, afin de le cliver (le couper) à cet endroit précis.

98
Q

Que permet de promouvoir CRISPR?

A

Coupures doubles brins à des endroits spécifiques des génomes

99
Q

Que stimule la coupure double brin de l’ADN?

A

On peut reparer l’adn par
recombinaison homologue (en utilisant un ADN identique) qui peut se faire à partir d’une séquence
d’ADN extérieur donc exogène.

100
Q

à lire sur l’ADN recombinant

A

Afin de perpétuer et produire l’ADN recombinant en
quantité illimitées Paul Berg a eu l’idée d’insérer l’ADN dans
un vecteur d’ADN qui peut se répliquer de façon autonome
Cette ligation du fragment d’ADN dans un vecteur est
couramment dite « Cloning »
Comme vecteur Paul Berg a utilisé un plasmide
Paul Berg a reçu le Prix Nobel en 1980 pour cette idée
Et cette idée a été la base du premier brevet en ADN
Recombinant

MMD1042 _ EXAM 3 _ Alex (9 decks)

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