Technologies de l'ADN Flashcards
Professeur: Dr Labbé
Que sont les nucléases?
Une nucléase est une enzyme qui clive les liaisons phosphodiester de brins acides nucléiques entre deux nucléotides
Qu’est-ce qu’une exonucléase?
Coupe les acides nucléiques (ADN ou ARN) à partir d’une extrémité, un nucléotide à la fois, et dans un sens 5’ -> 3’ ou dans le sens 3’ -> 5’
Qu’est-ce qu’une endonucléase?
Une enzyme qui coupe au milieu de la chaîne d’acide nucléique, produisant des fragments
Qu’est-ce les endonucléases de restriction?
Coupent l’ADN bicaténaire à des endroits caractérisés par des séquence de nucléotides spécifiques, dites Sites de Restrictions
Selon quoi sont nommés les enzymes de restrictions?
Selon l’espèce de bactérie d’origine
Les enzymes de restriction font partie d’un
système de _________ de bactéries
défense
Quelles séquences reconnaissent les enzymes de restrictions?
séquences palindromiques
Que résulte du clivage via HaeIII?
Bouts francs
Que résulte du clivage via EcoRI?
Bouts collants
Que résulte du clivage via HindIII?
Bouts collants
Est-ce que les enzymes de restrictions sont spécifiques à une seule séquence?
OUI
Pourquoi les enzymes de restrictions sont si importantes pour nous?
Caractère prédictif
Que peut-on faire de très très rudimentaire avec les enzymes de restrictions?
Cartographies
Une fois coupés, les fragments d’ADN peuvent être séparés selon la taille par…
Électrophorèse sur Gel d’Agarose
Explique le principe d’Électrophorèse sur Gel d’Agarose.
ADN est -
On met les fragments d’ADN dans un gel d’agarose et on active un courant électrique
ADN migre vers le + à différentes vitesses selon la taille (gros = lents)
Comment est-ce qu’on détecte les fragments d’ADN à la suite de l’électrophorèse?
Bromure d’Ethidium
(=agent intercalant)
+ UV
Après électrophorèses, que peut-on déduire de nos résultats?
La position des sites de restrictions sur le bout d’ADN à l’étude
Comment peut-on joindre deux fragments d’ADN ensemble?
Ligase
Nomme les deux types de liaisons de la ligation.
Ligation d’extrémités cohésives
Ligation d’extrémités franches
Qu’est-ce que la ligation?
Création d’ADN recombinant au laboratoire en joignant n’importe quels (deux ou plus) fragments d’ADN
Est-ce que les deux bouts cohésifs doivent êtres compatibles?
OUI
Est-ce que la ligase demande de l’ATP?
OUI
L’efficacité de ligation de bouts francs est ____ fois plus faible que celle de la ligation de bouts collants
100
Pourquoi l’efficacité de ligation de bouts francs est plus faible que celle des bouts collants?
Les bouts francs dépendent des contacts entre les deux fragments d’ADN dépendant de collisions aléatoires
Qu’Est-ce qu’un plasmide?
Est un cercle d’ADN bicaténaire qui peut se répliquer de façon autonome dans un organisme hôte
Qu’est-ce qui se retrouve dans un plasmide?
- Origine de réplication fonctionnel
- Gènes spécifiques qui codent pour des protéines nécessaires à sa réplication
Qu’est-ce qu’un vecteur?
Un vecteur est un plasmide, qui a été manipulé en laboratoire, dans lequel on peut insérer (cloner) des fragments d’ADN
Le vecteur est un plasmide contenant des séquences d’ADN requise pour…
- Réplication dans bactérie (origine de réplication)
- Gène de sélection (résistance aux antibiotiques)
- Sites de restrictions pour insérer des fragments d’ADN
- Site de multiclonage avec plusieurs dites de clonage en ligne
Explique le clonage d’un fragment d’ADN.
- Digestion du vecteur par enzymes de restriction
- Digestion des bouts du fragment d’ADN à insérer avec enzyme de restriction (Eco RI)
- Joindre les deux ADN avec la ligase (ligation)
- Plasmide recombinant
Est-ce que toutes les cellules vont accepter le plasmide recombinant?
NON, environ 1/2000
Alors comment va-t-on identifier les cellules qui ont reçu le plasmide?
On utilise un marqueur de sélection sur le plasmide tel que de gènes qui codent pour la résistance à un antibiotique, tel que l’ampicilline pour sélectionner les cellules (les clones) qui ont reçu le plasmide
Utilisations possible de l’ADN amplifié des bactéries?
- Pour préparer une grande quantité de l’insert afin de séquencer l’insert (l’ADN inséré)
- Pour poursuivre un autre clonage avec ce plasmide
- Pour la production de protéines recombinantes (insuline)
À quoi servent les protéines recombinantes?
Production de protéines d’intérêt médical
Explique l’utilisation d’un vecteur d’expression pour la production de protéines recombinantes thérapeutiques (Ex: l’insuline humaine).
- Promoteur bactérien (permettant l’initiation de la transcription)
- Clonage du gène (restriction, ligation)
- Transformation du plasmide d’expression dans des bactéries adéquates
- Surexpression et purification de la protéine produite en grandes quantités
À quoi servent les GFP?
permettent d’étudier l’en tant réel et in vivo
- Les niveaux de transcription d’un gène
- Les niveaux de traduction
- Localisation cellulaire de protéines
- Et co-localisation cellulaire
Que permettent les différents types de protéines fluorescentes?
permet la co-localisation de protéines et de structures cellulaire
Nomme les propriétés des ADN polymérases.
- Polymérisation toujours dans la direction 5’ -> 3’
- Ne peut pas initier la réplication à partir de rien
- Peut seulement ajouter des nouveaux nucléotides à un bout 3’ OH déjà existant
Amorce in vivo?
amorce ARN/fragment d’Okazaki
Amorce in vitro?
Oligonucléotide ADN ou ARN, 3’ du brin d’ADN en polymérisation
Matrice simple brin in vivo?
région simple brin de l’hélice ouverte par l’hélicase
Matrice simple brin in vitro?
ADN simple brin obtenu par dénaturation thermique
Nom du point d’inflexion de la courbe de dénaturation de l’ADN?
Melting temperature
Pourquoi la Tm d’un chaine de PolyAT est plus basse qu’une chaine de PolyGC?
CG = 3 ponts H
TA = 2 ponts H
Vrai ou faux? L’ADN dénaturé (simple brin) peut se renaturer (re-hybrider) en ADN double brin, lorsqu’on revient aux bonnes conditions (initiales)
Vrai
Explique le principe de l’hybridation.
- Dénaturation de l’ADN via hautes températures
- ADN simple brins
- Renaturation si baisse de la température
- Hybridation de l’ADN et re-appariment des brins
Explique la méthode de Sanger (méthode de terminaison de chaine).
- Séparation des brins et ajout d’amorce
- Ajout: des amorces, des désoxynucléotides (dG, dA, dT, dC), un des dNTPs est marqué pour détection
- Ajout d’un des didéoxynucléotides (ddNTP) par tube et de l’ADN polymérase pour polymérisation de l’ADN
- Séparation sur gel et détection des brins synthétisées par extension de l’amorce
- Lecture de la séquence sur gel
Grandeur et nature de l’amorce dans la méthode de terminaison de chaine?
- 15 à 30 nucléotides
- oligonucléotide complémentaire au brin d’ADN
- radioactive ou fluorescente
Que nous permet de lire la méthode de terminaison de chaine et pourquoi?
Puisqu’on aura à la fin la longueur de chaque brin d’ADN finissant par A, C, T ou G, on pourra en déduire la séquence du brin à l’étude
Sur quoi se base la méthode de Sanger?
Sur l’ajout dans l’ADN recopié de ddNTP, un dNTP modifié qui ne possède pas de OH sur l’extrémité 3’ et qui, par conséquent, termine la polymérisation de son brin d’ADN
Explique le cycle du PCR.
1) Séparation des brins (95oC)
2) Hybridation des amorces (55oC)
3) Synthèse par la TaqI ADN polymérase (72oC)
Localisation de la Taql ADN polymérase?
Thermus aquaticus qui vit à 70 degré
Combien de cycle de PCR?
20-30 d’environ 5 min chacun
Plus les amorces sont longues…
plus elles sont spécifiques
Taille suggéré d’amorce pour PCR?
15 à 30 nu
Nomme les deux sortes de séquences répétées en tandem junk.
STR
VNTR
Combien de fois un STR peut être répété dans un locus?
5 à 200 fois
Est-ce que le nb de répétition de STR varie entre les individus, pour un même locus?
OUI
Que permet les STR?
DNA fingerprinting
Combien de fois le VNTR peut être répété dans un même locus?
10 à 1,500
Décrit la méthode pour les tests de paternité.
Analyse des copies de la mère et du père par électrophorèse et comparaison avec celui du bébé (toutes les bandes du bébé doivent correspondre aux bandes de la maman ou du papa)
Plus le STR ou VNTR testé est _______, plus il est utile dans ce test de profil génétique.
polymorphique
Que sont les SNPs?
Polymorphismes d’un seul nucléotide (différence d’une seule base dans l’ADN)
Combien de SNPs par personne?
1/300 nucléotides
Que crée les SNPs pour une personne?
Motif d’ADN unique
Est-ce que les SNPs sont des cas aléatoires?
Non, c’est une variante dans la population (ex: cheveux plats)
Qu’est-ce qu’une mutation?
Changement de base qui touche mois de 1% de la population (moins commun que les SNPs)
Les SNPs peuvent être associés à différents ______________.
traits génétiques
Qu’amène de néfaste les SNPs?
Certaines maladies et cancer (ex: fibrose kystique)
SNPs causatifs
Causent un trait génétique, une maladie, une susceptibilité, une différence de réponse à un traitement
SNPs liés
Sont à proximité d’un gène causant un trait génétique, une maladie, une susceptibilité, une différence de réponse à un traitement. Ils ne causent pas de traits mais servent de marqueurs
SNPs des régions codantes
Peuvent affecter la séquence et la fonction des protéines
SNPs des régions non-codantes
Peuvent affecter l’épissage de pré-ARNm, la régulation d’un gène, niveau d‘expression
Qu’est-ce que le projet HapMap?
Identification des suceptibilités génétiques à des maladies
Décrit les objectifs du projet HapMap.
- Identifier de différences génétiques dans la population qui permettront de prédire la susceptibilité à des maladies
- Développer de tests génétiques pour prédire si un individu développera une maladie particulaire
- Offrir un traitement individualisé pour prévenir ou délayer le commencement de la maladie
Explique la médecine personnalisée.
L’utilisation d’analyses moléculaires pour aider les médecins dans le choix du traitement de la maladie d’un patient pour qu’il soit le plus efficace dans le contexte du profile génétique et environnemental du patient
Quelle est la caractéristique la plus saillante des enzymes de restriction?
Ce sont des enzymes qui reconnaissent et coupent l’ADN à des séquences spécifiques (sites de restriction)
Prédictibles
Sur un gel d’agarose, vers quel pôle migrent les fragments d’ADN?
+ (car ADN chargé -)
Que fait-on pour visualiser les fragments d’ADN sur un gel d’agarose?
Bromure d’Ethidium + UV
Peut-on liguer un fragment d’ADN ayant des bouts collants avec un autre fragment d’ADN ayant des bouts francs?
NONNNNNNN
Quels sont les éléments importants d’un vecteur général de clonage, et en particulier d’un vecteur d’expression?
- Origine de réplication
- Résistance aux antibiotiques
- Sites de restrictions
- Sites de multiclonages
Quelles sont les composantes essentielles d’une réaction de polymérisation de l’ADN in vitro?
- Amorce: Oligonucléotide ADN ou ARN, 3’ du brin d’ADN en polymérisation
- Matrice simple brin: chaleur
- Polymérase
Comment on obtient de l’ADN simple brin in vitro?
Chaleur = dénaturation
Quel composé provoque la terminaison de chaine dans la méthode de séquençage d’ADN de Sanger?
ddNTP
Quelles sont les 3 étapes d’un cycle de réaction PCR?
1) Séparation des brins (95oC)
2) Hybridation des amorces (55oC)
3) Synthèse par la TaqI ADN polymérase (72oC)
Dans une réaction de PCR, pourquoi faut-il chauffer à 95°C?
Pour dénaturer l’ADN et obtenir deux simples brins
Dans une réaction de PCR, combien de molécules d’ADN on obtient, à partir d’une seule molécule d’ADN, après 10 cycles, 20 cycles, 30 cycles?
2^10
2^20
2^30
Quelles sont les différences entre VNTR et STR?
STR: 2-6 nucléotides, 5-200 x
VNTR: 10-100 nucléotides, 10-1500 x
Comment peut-on déterminer l’identité d’un individu en laboratoire en utilisant un échantillon contenant de l’ADN?
Électrophorèse sur gel des deux échantillons et comparaison
Quelle est la différence entre SNP et mutation?
SNP: commune (toute plus de 1% de la pop)
Mutation: rares (moins de 1% de la pop)
Quelle est l’utilité des SNP liés?
Médecine personnalisée
Que permet de faire CRISPR?
Modifier de manière spécifique l’ADN
