Technologies de l'ADN Flashcards
Professeur: Dr Labbé
Que sont les nucléases?
Une nucléase est une enzyme qui clive les liaisons phosphodiester de brins acides nucléiques entre deux nucléotides
Qu’est-ce qu’une exonucléase?
Coupe les acides nucléiques (ADN ou ARN) à partir d’une extrémité, un nucléotide à la fois, et dans un sens 5’ -> 3’ ou dans le sens 3’ -> 5’
Qu’est-ce qu’une endonucléase?
Une enzyme qui coupe au milieu de la chaîne d’acide nucléique, produisant des fragments
Qu’est-ce les endonucléases de restriction?
Coupent l’ADN bicaténaire à des endroits caractérisés par des séquence de nucléotides spécifiques, dites Sites de Restrictions
Selon quoi sont nommés les enzymes de restrictions?
Selon l’espèce de bactérie d’origine
Les enzymes de restriction font partie d’un
système de _________ de bactéries
défense
Quelles séquences reconnaissent les enzymes de restrictions?
séquences palindromiques
Que résulte du clivage via HaeIII?
Bouts francs
Que résulte du clivage via EcoRI?
Bouts collants
Que résulte du clivage via HindIII?
Bouts collants
Est-ce que les enzymes de restrictions sont spécifiques à une seule séquence?
OUI
Pourquoi les enzymes de restrictions sont si importantes pour nous?
Caractère prédictif
Que peut-on faire de très très rudimentaire avec les enzymes de restrictions?
Cartographies
Une fois coupés, les fragments d’ADN peuvent être séparés selon la taille par…
Électrophorèse sur Gel d’Agarose
Explique le principe d’Électrophorèse sur Gel d’Agarose.
ADN est -
On met les fragments d’ADN dans un gel d’agarose et on active un courant électrique
ADN migre vers le + à différentes vitesses selon la taille (gros = lents)
Comment est-ce qu’on détecte les fragments d’ADN à la suite de l’électrophorèse?
Bromure d’Ethidium
(=agent intercalant)
+ UV
Après électrophorèses, que peut-on déduire de nos résultats?
La position des sites de restrictions sur le bout d’ADN à l’étude
Comment peut-on joindre deux fragments d’ADN ensemble?
Ligase
Nomme les deux types de liaisons de la ligation.
Ligation d’extrémités cohésives
Ligation d’extrémités franches
Qu’est-ce que la ligation?
Création d’ADN recombinant au laboratoire en joignant n’importe quels (deux ou plus) fragments d’ADN
Est-ce que les deux bouts cohésifs doivent êtres compatibles?
OUI
Est-ce que la ligase demande de l’ATP?
OUI
L’efficacité de ligation de bouts francs est ____ fois plus faible que celle de la ligation de bouts collants
100
Pourquoi l’efficacité de ligation de bouts francs est plus faible que celle des bouts collants?
Les bouts francs dépendent des contacts entre les deux fragments d’ADN dépendant de collisions aléatoires
Qu’Est-ce qu’un plasmide?
Est un cercle d’ADN bicaténaire qui peut se répliquer de façon autonome dans un organisme hôte
Qu’est-ce qui se retrouve dans un plasmide?
- Origine de réplication fonctionnel
- Gènes spécifiques qui codent pour des protéines nécessaires à sa réplication
Qu’est-ce qu’un vecteur?
Un vecteur est un plasmide, qui a été manipulé en laboratoire, dans lequel on peut insérer (cloner) des fragments d’ADN
Le vecteur est un plasmide contenant des séquences d’ADN requise pour…
- Réplication dans bactérie (origine de réplication)
- Gène de sélection (résistance aux antibiotiques)
- Sites de restrictions pour insérer des fragments d’ADN
- Site de multiclonage avec plusieurs dites de clonage en ligne
Explique le clonage d’un fragment d’ADN.
- Digestion du vecteur par enzymes de restriction
- Digestion des bouts du fragment d’ADN à insérer avec enzyme de restriction (Eco RI)
- Joindre les deux ADN avec la ligase (ligation)
- Plasmide recombinant
Est-ce que toutes les cellules vont accepter le plasmide recombinant?
NON, environ 1/2000
Alors comment va-t-on identifier les cellules qui ont reçu le plasmide?
On utilise un marqueur de sélection sur le plasmide tel que de gènes qui codent pour la résistance à un antibiotique, tel que l’ampicilline pour sélectionner les cellules (les clones) qui ont reçu le plasmide
Utilisations possible de l’ADN amplifié des bactéries?
- Pour préparer une grande quantité de l’insert afin de séquencer l’insert (l’ADN inséré)
- Pour poursuivre un autre clonage avec ce plasmide
- Pour la production de protéines recombinantes (insuline)
À quoi servent les protéines recombinantes?
Production de protéines d’intérêt médical
Explique l’utilisation d’un vecteur d’expression pour la production de protéines recombinantes thérapeutiques (Ex: l’insuline humaine).
- Promoteur bactérien (permettant l’initiation de la transcription)
- Clonage du gène (restriction, ligation)
- Transformation du plasmide d’expression dans des bactéries adéquates
- Surexpression et purification de la protéine produite en grandes quantités
À quoi servent les GFP?
permettent d’étudier l’en tant réel et in vivo
- Les niveaux de transcription d’un gène
- Les niveaux de traduction
- Localisation cellulaire de protéines
- Et co-localisation cellulaire
Que permettent les différents types de protéines fluorescentes?
permet la co-localisation de protéines et de structures cellulaire