Technologies de l'ADN Flashcards
Nucléase
Enzyme qui clive les liaisons phosphodiester de brins acides nucléiques entre deux nucléotides
Exonucléase
Enzyme qui coupe les acides nucléiques (ADN ou ARN) à partir d’une extrémité, un nucléotide à la fois, et dans un sens 5’-> 3’ou dans le sens 3’-> 5’
Endonucléase
Enzyme qui coupe au milieu de la chaîne d’acide nucléique, produisant des fragments
Endonucléases de restriction
Coupent l’ADN bicaténaire à des endroits caractérisés par des séquence de nucléotides spécifiques, dites Sites de Restrictions
Importance des enzymes de restriction
Servent à la défense contre les virus des bactéries
(les bactériophages) en coupant l’ADN étranger en morceaux
Enzymes de restriction
Enzymes qui reconnaissent et coupent l’ADN à des séquences spécifiques
La vaste majorité reconnaissent des séquences palindromiques
- Bouts francs
- Bouts collants
Séquence palindromique
Se lit de la même façon dans les deux directions
Électrophorèse sur gel d’agarose
Une fois coupés, les fragments d’ADN peuvent être séparés selon la taille
L’ADN est chargé négativement
Pour faire une analyse de restriction, après digestion, on peut séparer les fragments obtenus en appliquant un champs électrique
Ligation
Processus dans lequel deux fragments d’ADN peuvent être joints
Création d’ADN recombinant au laboratoire en joignant n’importe quels (deux ou plus) fragments d’ADN grâce à une ligase
Ligation d’extrémités franches
L’efficacité de ligation de bouts francs est 100 fois plus faible que celle de la ligation de bouts collants
car les bouts collants s’apparient donc stabilisent les interactions, tandis que pour les bouts francs les contacts entre les deux fragments d’ADN dépendent de collisions aléatoires
ADN recombinant
- Afin de perpétuer et produire l’ADN recombinant en quantité illimitées Paul Berg a eu l’idée d’insérer l’ADN dans un vecteur d’ADN qui peut se répliquer de façon autonome
- Cette ligation du fragment d’ADN dans un vecteur est couramment dite « Cloning »
- Comme vecteur Pau Berg a utilisé un plasmide
- Et cette idée a été la base du premier brevet en ADN recombinant
Plasmide
Cercle d’ADN bicaténaire qui peut se répliquer de façon autonome dans un organisme hôte
A une origine de réplication fonctionnel et les gènes spécifiques qui codent pour des protéines nécessaires à sa réplication dans l’organisme hôte
Vecteur
Plasmide qui a été manipulé en laboratoire, dans lequel on peut insérer (cloner) des fragments d’ADN
Plasmide contenant des séquences d’ADN
Requises pour:
- Réplication dans la bactérie (origine de réplication)
- Gène(s) de sélection (résistance à des antibiotiques), pour sélectionner spécifiquement les bactéries qui contiennent le vecteur (Ex pBR322, ampicilline et tétracycline)
- Sites de restriction dans lesquels on peut insérer des fragments d’ADN(Exemple pBR322 en bleu)
- Dans des versions plus tardives il y a un site de multicolonage, avec plusieurs site de clonage en ligne pour faciliter le clonage de fragments d’ADN (inserts)
Clonage d’un fragment d’ADN
Insertion d’un fragment d’ADN dans un vecteur
Transformation et sélection avec antibiotique des bactéries transformées
Procédé d’introduction d’un plasmide dans une souche de bactérie ou de levure
Efficacité de la transformation des bactéries
N’est pas 100% - pas toutes les cellules vont recevoir le plasmide
Au mieux l’efficacité de transformation est de 1/2000
Clonage d’un fragment d’ADN: sélection avec antibiotique des bactéries transformées
On utilise un marqueur de sélection sur le plasmide tel que de gènes qui codent pour la résistance à un antibiotique, tel que l’ampicilline pour sélectionner les cellules (les clones) qui ont reçu le plasmide
Utilisations possibles de l’ADN amplifié
- Pour préparer une grande quantité de l’insert afin de séquencer l’insert (l’ADN inséré)
- Pour poursuivre un autre clonage avec ce plasmide
- Pour la production de protéines recombinantes (telles que l’insuline humaine, hormone de croissance humaine, facteurs de coagulation, immunogènes pour vaccins, la lactase…)
Protéines recombinantes
Production de protéines d’intérêt médical (insuline) ou biotechnologique (enzymes qui digèrent la lignine du bois) par des méthodes d’ADN recombinant
Recombinant d’ADN
Vecteur d’expression
Utilisation d’un vecteur d’expression pour la production de protéines recombinantes thérapeutiques (EX: l’insuline humaine)
- Promoteur bactérien (permettant l’initiation de la transcription)
- Clonage du gène (restriction, ligation)
- Transformation du plasmide d’expression dans des bactéries adéquates
- Surexpression et purification de la protéine produite en grandes quantité (EX: insuline, hormones de croissance humaines)
GFP: Green Fluorescent Protein
Des fusions de gènes avec la GFP permettent d’étudier:
- Les niveaux de transcription d’un gène
- Les niveaux de traduction
- Localisation cellulaire de protéines
- Et co-localisation cellulaire
Protéines fluorescentes de différentes couleurs
Permet la co-localisation de protéines et de structure cellulaire
Protéines fluorescentes de différentes couleurs
Permet la co-localisation de protéines et de structure cellulaire
