Technologies de l'ADN Flashcards
Nucléase
Enzyme qui clive les liaisons phosphodiester de brins acides nucléiques entre deux nucléotides
Exonucléase
Enzyme qui coupe les acides nucléiques (ADN ou ARN) à partir d’une extrémité, un nucléotide à la fois, et dans un sens 5’-> 3’ou dans le sens 3’-> 5’
Endonucléase
Enzyme qui coupe au milieu de la chaîne d’acide nucléique, produisant des fragments
Endonucléases de restriction
Coupent l’ADN bicaténaire à des endroits caractérisés par des séquence de nucléotides spécifiques, dites Sites de Restrictions
Importance des enzymes de restriction
Servent à la défense contre les virus des bactéries
(les bactériophages) en coupant l’ADN étranger en morceaux
Enzymes de restriction
Enzymes qui reconnaissent et coupent l’ADN à des séquences spécifiques
La vaste majorité reconnaissent des séquences palindromiques
- Bouts francs
- Bouts collants
Séquence palindromique
Se lit de la même façon dans les deux directions
Électrophorèse sur gel d’agarose
Une fois coupés, les fragments d’ADN peuvent être séparés selon la taille
L’ADN est chargé négativement
Pour faire une analyse de restriction, après digestion, on peut séparer les fragments obtenus en appliquant un champs électrique
Ligation
Processus dans lequel deux fragments d’ADN peuvent être joints
Création d’ADN recombinant au laboratoire en joignant n’importe quels (deux ou plus) fragments d’ADN grâce à une ligase
Ligation d’extrémités franches
L’efficacité de ligation de bouts francs est 100 fois plus faible que celle de la ligation de bouts collants
car les bouts collants s’apparient donc stabilisent les interactions, tandis que pour les bouts francs les contacts entre les deux fragments d’ADN dépendent de collisions aléatoires
ADN recombinant
- Afin de perpétuer et produire l’ADN recombinant en quantité illimitées Paul Berg a eu l’idée d’insérer l’ADN dans un vecteur d’ADN qui peut se répliquer de façon autonome
- Cette ligation du fragment d’ADN dans un vecteur est couramment dite « Cloning »
- Comme vecteur Pau Berg a utilisé un plasmide
- Et cette idée a été la base du premier brevet en ADN recombinant
Plasmide
Cercle d’ADN bicaténaire qui peut se répliquer de façon autonome dans un organisme hôte
A une origine de réplication fonctionnel et les gènes spécifiques qui codent pour des protéines nécessaires à sa réplication dans l’organisme hôte
Vecteur
Plasmide qui a été manipulé en laboratoire, dans lequel on peut insérer (cloner) des fragments d’ADN
Plasmide contenant des séquences d’ADN
Requises pour:
- Réplication dans la bactérie (origine de réplication)
- Gène(s) de sélection (résistance à des antibiotiques), pour sélectionner spécifiquement les bactéries qui contiennent le vecteur (Ex pBR322, ampicilline et tétracycline)
- Sites de restriction dans lesquels on peut insérer des fragments d’ADN(Exemple pBR322 en bleu)
- Dans des versions plus tardives il y a un site de multicolonage, avec plusieurs site de clonage en ligne pour faciliter le clonage de fragments d’ADN (inserts)
Clonage d’un fragment d’ADN
Insertion d’un fragment d’ADN dans un vecteur
Transformation et sélection avec antibiotique des bactéries transformées
Procédé d’introduction d’un plasmide dans une souche de bactérie ou de levure
Efficacité de la transformation des bactéries
N’est pas 100% - pas toutes les cellules vont recevoir le plasmide
Au mieux l’efficacité de transformation est de 1/2000
Clonage d’un fragment d’ADN: sélection avec antibiotique des bactéries transformées
On utilise un marqueur de sélection sur le plasmide tel que de gènes qui codent pour la résistance à un antibiotique, tel que l’ampicilline pour sélectionner les cellules (les clones) qui ont reçu le plasmide
Utilisations possibles de l’ADN amplifié
- Pour préparer une grande quantité de l’insert afin de séquencer l’insert (l’ADN inséré)
- Pour poursuivre un autre clonage avec ce plasmide
- Pour la production de protéines recombinantes (telles que l’insuline humaine, hormone de croissance humaine, facteurs de coagulation, immunogènes pour vaccins, la lactase…)
Protéines recombinantes
Production de protéines d’intérêt médical (insuline) ou biotechnologique (enzymes qui digèrent la lignine du bois) par des méthodes d’ADN recombinant
Recombinant d’ADN
Vecteur d’expression
Utilisation d’un vecteur d’expression pour la production de protéines recombinantes thérapeutiques (EX: l’insuline humaine)
- Promoteur bactérien (permettant l’initiation de la transcription)
- Clonage du gène (restriction, ligation)
- Transformation du plasmide d’expression dans des bactéries adéquates
- Surexpression et purification de la protéine produite en grandes quantité (EX: insuline, hormones de croissance humaines)
GFP: Green Fluorescent Protein
Des fusions de gènes avec la GFP permettent d’étudier:
- Les niveaux de transcription d’un gène
- Les niveaux de traduction
- Localisation cellulaire de protéines
- Et co-localisation cellulaire
Protéines fluorescentes de différentes couleurs
Permet la co-localisation de protéines et de structure cellulaire
Protéines fluorescentes de différentes couleurs
Permet la co-localisation de protéines et de structure cellulaire
Propriétés des ADN polymérases
- Polymérisation toujours dans la direction 5’ -> 3’
- Ne peut pas initier la réplication à partir de rien: peut seulement ajouter des nouveaux nucléotides à un bout 3’ OH déjà existant
ADN polymérase: besoin d’amorce
- In vivo: brin d’ADN en polymérisation (brin conducteur), amorce ARN/fragment d’Okazaki (brin retardé, ou tardif)
- In vitro: Oligonucléotide ADN ou ARN, 3’ du brin d’ADN en polymérisation
ADN polymérase: besoin de matrice simple brin
- In vivo: région simple brin de l’hélice ouverte par l’hélicase
- In vitro: ADN simple brin obtenu par dénaturation thermique
Principe de l’hybridation
L’ADN dénaturé (simple brin) peut se renaturer (re-hybrider) en ADN double-brin, lorsqu’on revient aux bonnes conditions (initiales)
Renaturation selon la règle G-C et A-T
Méthode de Sanger
Méthode de terminaison de chaîne (appelée aussi du didéoxy)
Moyen pour détecter une mutation dans un gène
Méthode de terminaison de chaine
1) Séparation des brins et ajout d’amorce
2) Ajout: des amorces, des désoxynucléotides (dG, dA, dT, dC), un des dNTPs est marqué pour détection
Ajout d’un des didéoxynucléotides (ddNTP) par tube et de l’ADN polymérase pour polymérisation de l’ADN
3) Séparation sur gel et détection des brins synthétisées par extension de l’amorce
4) Lecture de la séquence sur gel
Amorce
~15 à 30 nucléotides
Oligonucléotide complémentaire au brin d’ADN matrice qui est radioactive ou fluorescente
La polymérase permet d’ajouter des dNTP et à polymériser l’ADN en 3’ de l’amorce
Plus les amorces sont longues, plus elles sont spécifiques (moins de chance de reconnaître plus d’un endroit dans le génome)
Principe du PCR (polymerase-chain reaction)
1) Séparation des brins (95˚C)
2) Hybridation des amorces (55˚C)
3) Synthèse par la Taq polymérase (72˚C)
Amplifications faites par 20-30 cycles d’environ 5 min chacun
Taql ADN polymerase
Thermus aquaticus qui vit à 70˚C
STR
Short Tandem Repeats (2-6 nucléotides) qui peuvent être répétées de 5 à 200 fois, une après l’autre (en tandem) dans un même locus
Le génome humain a 50 000 à 100 000 di-nucléotides répétés et un
moindre nombre de tri, tétra et penta-nucléotides répétés
Locus
Emplacement physique précis et invariable sur un chromosome
Peut être un endroit du chromosome où se situe un gène, ou pas
DNA fingerprinting
Nombre de STR varie dans un même locus pour chaque individu
VNTR
Variable Number of Tandem Repeats (10-100 nucléotides)
Peuvent être répétées 10 -1,500 de fois dans un même locus
STR et VNTR: détermination de la paternité
Dans ces études de profil, les deux copies (copie du père et de la mère) sont analysées. Si les deux copies du VNTR et/ou STR n’ont pas le même nombre de séquences, répétées on voit deux bandes
Plus le STR ou VNTR testé est polymorphique (nombre de séquences répétées très variable selon les individus), plus il est utile dans ce test de profil génétique
Comparaison entre la séquence d’ADN de deux personnes choisies au hasard
- Identique à 99.9%
- 0.1% restant = variations qui caractérisent chaque individu génétiquement
- Variations peuvent fortement affecter le risque de maladie d’un individu
SNP
Polymorphismes de nucléotides simples: sites dans la séquence d’ADN où les individus diffèrent selon une seule base d’ADN qui est maintenu par l’hérédité
SNP chez les individus
- Chaque individu a de nombreux SNPs: 1/300 nucléotides (environ 10 millions de SNP/génome humain de 3 milliards de nucléotides)
- Ensemble, les SNPs créent un motif d’ADN unique pour chaque individu
- Les SNPs aideront à améliorer notre capacité à comprendre et à traiter les maladies humaines
SNP vs. mutation
- SNP: variation de base d’ADN simple trouvée > 1% de la population
- Mutations: variation de base d<ADN simple trouvée < 1% de la population
Traits génétiques associés aux SNPs
- Couleur des yeux et de cheveux
- Performance musculaire
- Comportement social
- Hérédité et susceptibilité à des maladies
- Réponse individuelle aux médicaments
SNPs associées à différents traits génétiques
- SNPs liés
- SNPs causatifs: SNPs des régions codantes, SNPs des régions non-codantes
SNPs liés
- À proximité d’un gène causant un trait génétique, une maladie, une susceptibilité, une différence de réponse à un traitement
- Ne causent pas de traits mais servent de marqueurs
SNPs causatifs
Causent un trait génétique, une maladie, une susceptibilité, une différence de réponse à un traitement
SNPs des régions codantes
Peuvent affecter la séquence et la fonction des protéines
SNPs des régions non-codantes
Peuvent affecter l’épissage de pré-ARNm, la régulation d’un gène, niveau d’expression
Projet HapMap: but
Réduire le nombre de SNPs requis pour examiner l’ensemble du génome pour l’association avec un phénotype (maladie, sensibilité, réponse au traitement, etc)
(réduire de 10 millions de SNPs dans le génomes à environ 500 000 SNPs étiquettes)
Permettra des études du génome beaucoup plus efficaces et complètes pour trouver des régions avec des gènes qui affectent les maladies - plus d’effort gaspillé à typer les SNPs et toutes les régions du génome peuvent être incluses
HapMap: identification des susceptibilités génétiques à des maladies
- Identifier des différences génétiques dans la population qui permettront de prédire la susceptibilité à des maladies
- Développer des tests génétiques pour prédire si un individu développera une maladie particulaire
- Offrir un traitement individualisé pour prévenir ou délayer le commencement de la maladie
Médecine traditionnelle
- “Educated guess” sur quel est le meilleur traitement à
prescrire - Chaque année, plus de 106,000 personnes meurent aux USA de réactions adverses à des médicaments prescrits correctement
- D’autres 2.2 millions souffrent de graves des effets secondaires mais pas mortels
Médecine personnalisée
- Résultats des études génomiques seront utilisés
- Utilisation d’analyses moléculaires pour aider les médecins dans le choix du traitement de la maladie d’un patient pour qu’il soit le plus efficace dans le contexte du profile génétique et environnemental du patient
Médecine traditionnelle
- “Educated guess” sur quel est le meilleur traitement à
prescrire - Chaque année, plus de 106,000 personnes meurent aux USA de réactions adverses à des médicaments prescrits correctement
- D’autres 2.2 millions souffrent de graves des effets secondaires mais pas mortels
