TECHNOLOGIES Flashcards
Qu’est-ce qu’une nucléase?
Une nucléase est une enzyme qui clive les liaisons phosphodiester de brins acides nucléiques entre deux nucléotides
Définir endonucléase
Certaines endonucléases (une enzyme qui coupe au milieu de la chaîne d’acide nucléique, produisant des fragments) dites endonucléases de restriction ou enzymes de restriction coupent l’ADN bicaténaire à des endroits caractérisés par des séquences de nucléotides spécifiques, dites SITES DE RESCTRICTION
Pourquoi les bactéries ont des enzymes de restriction?
Servent à la défense contre les virus des bactéries (les bactériophages) en coupant l’ADN étranger en morceaux
Les enzymes de restrictions sont nommées selon l’espèce de bactérie desquelles ont été isolées
Par exemple : EcoRI a été isolée d’Escherichia coli souche RY13
Les enzymes de restriction font partie d’un système de défense de bactéries
Décrire les enzymes de restriction
Enzymes de restriction
-ce sont des enzymes qui reconnaissent et coupent l’ADN à des séquences spécifiques
-la vaste majorité reconnaissent des séquences palindromiques (se lit de la même façon dans les 2 directions)
5’GAATTC3’
3’CTTAAG5’
-peut donner des bouts francs (pas tendance à se recoller) et des bouts collants
Lire même séquences des 2 directions se nomme
Palindromique
Sur un gel d’agarose, vers quel pôle migrent les fragments d’ADN
Moins vers plus
Comment séparer et identifier les fragments d’ADN coupé après digestion avec des enzymes de restriction
Une fois coupés, les fragments d’ADN peuvent être séparés selon la taille par électrophorèse sur gel d’agarose
-L’ADN est chargé négativement
-Pour faire une analyse de restriction, après digestion, on peut séparer les fragments obtenus en appliquant un champs électrique
a. Les échantillons sont déposés au pôle négatif (cathode)
b. Puisque l’ADN est chargé négativement, les fragments vont se déplacer vers le pôle positif (anodes +)
1. Petits fragments = plus rapide
2. Fragments de même taille = migrent à la même vitesse (vers l’anode +)
Que fait-on pour visualiser les fragments d’ADN sur un gel d’agarose?
Détection : bromure d’éthidium pcq l’ADN est invisible (agent intercalant à l’intérieur de la double hélice) + UV (visualisation de l’ADN dans un gel d’agarose sous la lumière UV, on peut y voir des bandes (lignes) fluorescentes qui correspondent à l’ADN)
Peut-on liguer un fragment d’ADN ayant des bouts collants avec un autre fragment d’ADN ayant des bouts francs
-Deux fragments d’ADN peuvent être joints dans un processus qui s’appelle “Ligation”
-création d’ADN recombinant au laboratoire en joignant n’importe quels (deux ou plus) fragments d’ADN grâce à une ligase
-ligation d’extrémités cohésives, bouts cohésifs compatibles (deux fragments d’ADN coupés avec EcoRI par exemple)
BOUTS FRANCS
-l’efficacité de ligation de bouts francs est 100 fois plus faible que celle de la ligation de bouts collants, car les bouts francs s’apparient selon des collisions aléatoires
-extrémités qui ont été coupés droits = séquence coupée de manière symétrique
BOUTS COLLANTS
-Efficacité 100 fois plus forte car les bouts collants s’apparient ensemble (comme 2 morceaux de casse-tête)
-extrémités qui ont été coupées en biais = séquence coupée de manière asymétrique
Définir plasmide
Est un cercle d’ADN bicaténaire qui peut se répliquer de façon autonome dans un organisme hôte
Quels sont les 2 éléments qu’un plasmide doit posséder pour pouvoir se répliquer de façon autonome
-une origine de réplication fonctionnelle
-les gènes spécifiques qui codent pour des protéines nécessaires à sa réplication
Un plasmide doit contenir des séquences d’ADN requises pour..
-la réplication dans la bactérie (origine de réplication)
-un gène de sélection (résistance à des antibiotiques), pour sélectionner spécifiquement les bactéries qui contiennent le vecteur
-site de restriction dans lesquels on peut insérer des fragments d’ADN
-dans des versions plus tardives, il y a un site de multiclonage, avec plusieurs sites de clonage en ligne pour faciliter le clonage de fragments d’ADN (inserts)
Définir vecteur
Est un plasmide qui a été manipulé en laboratoire, dans lequel on peut insérer des fragments d’ADN
Définir clônage
L’insertion d’un fragment d’ADN dans un vecteur
Comment nomme-t-on le procédé d’introduction d’un plasmide dans une souche de bactérie ou de levure
Transformation
Quelle est l’efficacité de transformation?
Transformation est le procédé d’introduction d’un plasmide dans un souche de bactérie ou de levure
-l’efficacité de transformation n’est pas 100% (pas toutes les cellules vont recevoir le plasmide)
-au mieux, l’efficacité de transformation est de environ 1/2000
Comment va-t-on identifier les cellules qui ont reçu un plasmide
-on utilise un marqueur de sélection sur le plasmide tel que des gènes qui codent pour la résistance à un antibiotique tel que l’ampicilline pour sélectionner les cellules (les clones) qui ont reçu un plasmide (ceux qui ne l’ont pas reçu vont mourir)
Sélectionner des cellules qui ont reçu un plasmide, qu’arrive-t-il quand on met/met pas antibio dans le milieu
-avec antibiotique dans le milieu, seulement les bactéries transformées avec le plasmide forment des colonies
-sans antibiotique dans le milieu, toutes les bactéries forment des colonies
Nommez les 3 utilisations possibles de l’ADN amplifié
- Préparation d’une grande quantité de l’insert afin de le morceler/séquence (ADN inséré)
- Poursuite d’un autre clonage avec ce plasmide
- Production de protéines recombinantes thérapeutiques (telles que l’insuline humaine, hormone de croissance humaine HGH, facteurs de coagulation, etc)
La polymérisation se fait dans quel sens
5 vers 3 PEU IMPORTE IN VIVO OU IN VITRO
L’ADN polymérase ne peut pas initier la réplication, mais elle peut ajouter des nucléotides comment
À un bout 3’OH déjà existant
Amorce in vivo
brin d’ADN en polymérisation (brin conducteur) amorce ARN/fragment d’Okazaki (brin retardé, ou tardif)
Amorce in vitro
Oligonucléotide ADN ou ARN, 3’ du brin d’ADN en polymérisation
L’ADN poly est tjrs dépendante de quoi
Une matrice simple brin
