TECHNOLOGIES Flashcards
Qu’est-ce qu’une nucléase?
Une nucléase est une enzyme qui clive les liaisons phosphodiester de brins acides nucléiques entre deux nucléotides
Définir endonucléase
Certaines endonucléases (une enzyme qui coupe au milieu de la chaîne d’acide nucléique, produisant des fragments) dites endonucléases de restriction ou enzymes de restriction coupent l’ADN bicaténaire à des endroits caractérisés par des séquences de nucléotides spécifiques, dites SITES DE RESCTRICTION
Pourquoi les bactéries ont des enzymes de restriction?
Servent à la défense contre les virus des bactéries (les bactériophages) en coupant l’ADN étranger en morceaux
Les enzymes de restrictions sont nommées selon l’espèce de bactérie desquelles ont été isolées
Par exemple : EcoRI a été isolée d’Escherichia coli souche RY13
Les enzymes de restriction font partie d’un système de défense de bactéries
Décrire les enzymes de restriction
Enzymes de restriction
-ce sont des enzymes qui reconnaissent et coupent l’ADN à des séquences spécifiques
-la vaste majorité reconnaissent des séquences palindromiques (se lit de la même façon dans les 2 directions)
5’GAATTC3’
3’CTTAAG5’
-peut donner des bouts francs (pas tendance à se recoller) et des bouts collants
Lire même séquences des 2 directions se nomme
Palindromique
Sur un gel d’agarose, vers quel pôle migrent les fragments d’ADN
Moins vers plus
Comment séparer et identifier les fragments d’ADN coupé après digestion avec des enzymes de restriction
Une fois coupés, les fragments d’ADN peuvent être séparés selon la taille par électrophorèse sur gel d’agarose
-L’ADN est chargé négativement
-Pour faire une analyse de restriction, après digestion, on peut séparer les fragments obtenus en appliquant un champs électrique
a. Les échantillons sont déposés au pôle négatif (cathode)
b. Puisque l’ADN est chargé négativement, les fragments vont se déplacer vers le pôle positif (anodes +)
1. Petits fragments = plus rapide
2. Fragments de même taille = migrent à la même vitesse (vers l’anode +)
Que fait-on pour visualiser les fragments d’ADN sur un gel d’agarose?
Détection : bromure d’éthidium pcq l’ADN est invisible (agent intercalant à l’intérieur de la double hélice) + UV (visualisation de l’ADN dans un gel d’agarose sous la lumière UV, on peut y voir des bandes (lignes) fluorescentes qui correspondent à l’ADN)
Peut-on liguer un fragment d’ADN ayant des bouts collants avec un autre fragment d’ADN ayant des bouts francs
-Deux fragments d’ADN peuvent être joints dans un processus qui s’appelle “Ligation”
-création d’ADN recombinant au laboratoire en joignant n’importe quels (deux ou plus) fragments d’ADN grâce à une ligase
-ligation d’extrémités cohésives, bouts cohésifs compatibles (deux fragments d’ADN coupés avec EcoRI par exemple)
BOUTS FRANCS
-l’efficacité de ligation de bouts francs est 100 fois plus faible que celle de la ligation de bouts collants, car les bouts francs s’apparient selon des collisions aléatoires
-extrémités qui ont été coupés droits = séquence coupée de manière symétrique
BOUTS COLLANTS
-Efficacité 100 fois plus forte car les bouts collants s’apparient ensemble (comme 2 morceaux de casse-tête)
-extrémités qui ont été coupées en biais = séquence coupée de manière asymétrique
Définir plasmide
Est un cercle d’ADN bicaténaire qui peut se répliquer de façon autonome dans un organisme hôte
Quels sont les 2 éléments qu’un plasmide doit posséder pour pouvoir se répliquer de façon autonome
-une origine de réplication fonctionnelle
-les gènes spécifiques qui codent pour des protéines nécessaires à sa réplication
Un plasmide doit contenir des séquences d’ADN requises pour..
-la réplication dans la bactérie (origine de réplication)
-un gène de sélection (résistance à des antibiotiques), pour sélectionner spécifiquement les bactéries qui contiennent le vecteur
-site de restriction dans lesquels on peut insérer des fragments d’ADN
-dans des versions plus tardives, il y a un site de multiclonage, avec plusieurs sites de clonage en ligne pour faciliter le clonage de fragments d’ADN (inserts)
Définir vecteur
Est un plasmide qui a été manipulé en laboratoire, dans lequel on peut insérer des fragments d’ADN
Définir clônage
L’insertion d’un fragment d’ADN dans un vecteur
Comment nomme-t-on le procédé d’introduction d’un plasmide dans une souche de bactérie ou de levure
Transformation
Quelle est l’efficacité de transformation?
Transformation est le procédé d’introduction d’un plasmide dans un souche de bactérie ou de levure
-l’efficacité de transformation n’est pas 100% (pas toutes les cellules vont recevoir le plasmide)
-au mieux, l’efficacité de transformation est de environ 1/2000
Comment va-t-on identifier les cellules qui ont reçu un plasmide
-on utilise un marqueur de sélection sur le plasmide tel que des gènes qui codent pour la résistance à un antibiotique tel que l’ampicilline pour sélectionner les cellules (les clones) qui ont reçu un plasmide (ceux qui ne l’ont pas reçu vont mourir)
Sélectionner des cellules qui ont reçu un plasmide, qu’arrive-t-il quand on met/met pas antibio dans le milieu
-avec antibiotique dans le milieu, seulement les bactéries transformées avec le plasmide forment des colonies
-sans antibiotique dans le milieu, toutes les bactéries forment des colonies
Nommez les 3 utilisations possibles de l’ADN amplifié
- Préparation d’une grande quantité de l’insert afin de le morceler/séquence (ADN inséré)
- Poursuite d’un autre clonage avec ce plasmide
- Production de protéines recombinantes thérapeutiques (telles que l’insuline humaine, hormone de croissance humaine HGH, facteurs de coagulation, etc)
La polymérisation se fait dans quel sens
5 vers 3 PEU IMPORTE IN VIVO OU IN VITRO
L’ADN polymérase ne peut pas initier la réplication, mais elle peut ajouter des nucléotides comment
À un bout 3’OH déjà existant
Amorce in vivo
brin d’ADN en polymérisation (brin conducteur) amorce ARN/fragment d’Okazaki (brin retardé, ou tardif)
Amorce in vitro
Oligonucléotide ADN ou ARN, 3’ du brin d’ADN en polymérisation
L’ADN poly est tjrs dépendante de quoi
Une matrice simple brin
Matrice simple brin in vivo
In vivo : région simple brin de l’hélice ouverte par l’hélicase
Matrice simple brin in vitro
In vitro : ADN simple brin obtenu par dénaturation thermique
On augmente la température :
-ADN passe de double-brin à simple brin
-absorbance à 260 nm augmente
Pourquoi? En raison du principe d’hybridation
1. On a une ADN double brin
2. Augmentation pH ou température = dénaturation
3. Bris des appariements des bases (G-C et A-T) = formation d’un ADN simple brin
pour dénaturer G-C (3 ponts H) il faut une température plus élevée que pour dénaturer A-T (2 ponts H)
4. Baisse de pH ou température pour revenir aux conditions initiales = hybridation
5. Retour à l’ADN double brin initial = re-appariement des brins (lorsqu’on revient aux bonnes conditions initiales)
Quel composé provoque la terminaison de chaine dans la méthode de séquençage d’ADN de Sanger?
(2) ddNTP : didéoxyribonucléotide triphosphate entraîne la terminaison de chaîne en raison de l’absence de OH sur son extrémité 3’
Explication méthode de sanger
Méthode de Sanger (méthode de terminaison de chaîne)
-méthode de terminaison de chaîne (appelée aussi didéoxy)
-moyen pour détecter une mutation dans un gène
-utilisation de 2 types de ribonucléotides
(1) dNTP : désoxyribonucléotide triphosphate dont l’extrémité 3’ OH permet la synthèse de l’ADN
(2) ddNTP : didéoxyribonucléotide triphosphate entraîne la terminaison de chaîne en raison de l’absence de OH sur son extrémité 3’
Étapes :
1. Séparation des brins
- Ajout des amorces, des désoxynucléotides (dG, dA, dT, dC), un des dNTPs est marqué pour détection
-ajout d’un des didéoxynucléotide ddNTP par tube et de l’ADN polymérase pour polymérisation de l’ADN - Séparation sur gel et détection des brins synthétisées par extension de l’amorce
- Lecture de la séquence sur gel
L’amorce (environ 15 à 30 nucléotides) est un oligonucléotide complémentaire au brin d’ADN matrice. L’amorce est radioactive ou fluorescente. La polymérase permet d’ajouter des dNTP et à polymériser l’ADN en 3’ de l’amorce
Quelles sont les 3 étapes d’un cycle de réaction PCR
E. Coli
1. Séparation des brins (95 C)
2. Hybridation des amorces (55 C)
3. Synthèse par l’ADN polymérase d’E. Coli (37)
Termus aquaticus
1. Dénaturation : séparation des brins (95 C)
2. Hybridation des amorces (55 degrés)
3. Synthèse par la Taql ADN polymérase (72 degrés) (thermus aquaticus vit à 70 C)
Dans une réaction de PCR, pourquoi faut-il chauffer à 95 C?
Dans une réaction de PCR, pourquoi faut-il chauffer à 95 C?
Pour séparer les 2 brins d’ADN, dénaturation
Dans une réaction de PCR, combien de molécules d’ADN on obtient, à partir d’une seule molécule d’ADN, après 10 cycles, 20 cycles, 30
Dans une réaction de PCR, combien de molécules d’ADN on obtient, à partir d’une seule molécule d’ADN, après 10 cycles, 20 cycles, 30 cycles?
10 (PRC cycles) : 1024 (target copies)
20 : 1,048,576
30 : 1,073,741,842
Quelles sont les différences entre VNTR et STR
Séquences répétées en tandem
STR : short tandem repeats (2 à 6 nucléotides)
-ces séquences peuvent être répétées 5 à 200 fois, une après l’autre (en Tandem) dans un même locus
-le génome humain a 50k à 100k di-nucléotides répétés et un moindre nombre de tri, trétra et penta-nucléotides répétés
-le nbr varie dans un locus pour chaque individu
-utiles pour le “DNA FINGERPRINTING” en médecine légale
VNTR : variable number of tandem repeats (10 à 100 nucléotides)
-ces séquences peuvent être répétées de 10 à 1500 fois dans un même locus
Si les 2 copies du VNTR et/ou STR n’ont pas le même nbr de séquences on voit quoi
2 bandes
Plus le str ou vntr testé est polymorphique
Plus il est utile dans ce test de profil génétique
Utilisation PCR en médecine légale, nommez 2
-détermination de la paternité
-identification de cadavres
Différence SNP et mutation
SNP : variation de bases d’ADN simple trouvée > 1% de la population (ça veut dire que c’est une variante dans la population et non pas un cas aléatoire)
MUTATION : variation de base d’ADN simple trouvée < 1% de la population
Description SNP liés
Sont à proximité d’un gène causant un trait génétique, une maladie, une susceptibilité, une différence de réponse à un traitement. NE CAUSENT PAS DE TRAITS MAIS SERVENT DE MARQUEURS
