Techniques immunologiques

Question 1

Nommer des interférences analytiques possible pour les immunoessais

Answer 1

• Effet crochet
• Spécificité parfois douteuse (réactivité croisée)
• Auto-anticorps
• Anticorps hétérophiles
• HAMA (human anti-mouse antibody)
• Facteur rhumatoïde
• Biotine

Question 2

Comment peut-on réduire l’effet interférant des anticorps hétérophiles? (OCQ 2010)

Answer 2

• Dilution de l’échantillon
• Éliminer les Ab interférant avant le dosage
  
  • Ultracentrifugation
  • Précipitation au PEG
• Bloquer les Ab interférants de façon spécifique ou non spécifique
  
  • Globulines non-immunes
  • Ig anti-Ab hétérophile
• Doser avec un autre immunoessais employant des Ab différents

Question 3

Donner les avantages/inconvénients pour la néphélémétrie et la turbidimétrie.

(OCQ 2010)

Answer 3

Avantage:

La néphélémétrie est souvent plus sensible et souffre moins d’interférences endogènes que la turbidimétrie.

Inconvénients:

La néphélémétrie est plus $$$ et requiert de l’équipement spécialisé:

• Mesure de turbidimétrie possible dans les multianalyseurs alors que seulement le Vista de Siemens possède l’équipement pour les mesures de néphélémétrie
  
  • Prend beaucoup de place dans le multianalyseur à cause du détecteur placé en angle par rapport au faisceau incident
  • Néphélémétrie n’est donc pas toujours disponible
• Détecteur plus sensible requis pour la néphélémétrie

Question 4

Donner les avantages/inconvénients des dosages immunologiques compétitifs et de types « sandwich ». (OCQ 2010)

Answer 4

Les immunoessais non-compétitifs sont souvent plus spécifiques, plus sensibles et moins susceptibles aux interférences que les immunoessais compétitifs.

Question 5

Quel est le principe général de la technique de dosage immunologique (immunoessais) ?

Answer 5

Le principe principal de la technologie de dosage immunologique est que la liaison de l’analyte avec une molécule de liaison spécifique doit générer une différence de signal entre l’analyte libre et celui lié.

Question 6

Quelle est la différence entre un immunoessais homogène et hétérogène?

Answer 6

Homogène : Pas de séparation nécessaire de l’anticorps lié et non-lié pour mesurer le signal

Hétérogène : Anticorps lié doit être séparé de l’anticorps non-lié pour mesurer le signal

Question 7

Quel est le principe général d’un immunoessais compétitif? Nommer un exemple d’immunoessais compétitif

Answer 7

Principe d’un immunoessais compétitif:

• Ajout d’une quantité prédéterminée d’anticorps et d’antigène marqué (Ag*) à l’échantillon.
• L’analyte à doser compétitionne avec Ag* pour lier l’anticorps.
• Le signal est produit à partir de la molécule marquée
  
  • Si le signal est produit par Ag* lié à l’anticorps : Inversement proportionnel à [analyte]
  • Si le signal est produit lorsque l’analyte est lié à l’anticorps (Ag* libre) : Directement proportionnel à [analyte]

Exemples d’immunoessais compétitifs :

• EMIT : compétitif homogène, signal directement proportionnel à la concentration d’analyte
• CEDIA : compétitif homogène, signal directement proportionnel à la concentration d’analyte
• Électrochimiluminescence (ECL/ECLIA/CLIA) : compétitif quasi-hétérogène, signal inversement proportionnel (si le signal provient de l’Ag lié à l’Ab)

Question 8

Décrire les principes pour la néphélométrie et la turbidimétrie. (OCQ 2010)

Answer 8

Turbidimétrie :

• Mesure de la turbidité de l’échantillon
• Turbidité créée par des particules de latex liées à un Ag (compétitif) ou à un Ab (non-compétitif)
• Mesure de la réduction de la transmittance (augmentation de l’absorbance) proportionnelle à la turbidité qui augmente
• Mesure en point final ou en taux turbidimétrique

Néphélométrie:

• Mesure de la lumière diffusée (à 90° ou vers l’avant) par rapport au faisceau incident
• Utilisation d’Ab ou d’Ag lié à des particules de latex
  
  • Compétitif : Ag lié à des particules
  • Non-compétitif : Ab lié à des particules
• Signal inversement ou directement proportionnel selon si compétitif ou non-compétitif

Question 9

Quel est le principe d’un immunoessais non-compétitif LOCI?

Answer 9

LOCI : Luminescent oxygen channeling immunoassay

• Utilisation d’un Ab marqué avec la biotine et d’un Ab associé à une particule chemiluminescente
• Formation de la sandwich lors de l’ajout de l’échantillon
• Ajout d’une particule photosensible liée à la streptavidine. Liaison Streptavidine-Biotine
• Excitation de la particule photosensible à l’aide de la lumière, production d’O2 singulet
• L’O2 singulet active la particule chimiluminescente qui émet un signal lumineux

Immunoessais non-compétitif (sandwich), homogène et dont le signal est directement proportionnel à la concentration de l’analyte

Ex: dosage prolactine

Question 10

Quel est le principe d’un immunoessais compétitif LOCI?

Answer 10

LOCI : Luminescent oxygen channeling immunoassay

• Utilisation d’un Ab marqué avec la biotine
• Liaison de l’Ab et de l’analyte à doser
• Ajout d’un Ag associé à une particule chemiluminescente (Ag*). Liaison des Ab libres résiduels
• Ajout d’une particule photosensible liée à la streptavidine. Liaison Streptavidine-Biotine
• Excitation de la particule photosensible à l’aide de la lumière, production d’O2 singulet
• L’O2 singulet active la particule chimiluminescente qui émet un signal lumineux seulement lorsque les particules sont étroitement liées via la liaison Ab-Ag*

Immunoessais compétitif, homogène et dont le signal est inversement proportionnel à la concentration de l’analyte

Ex: dosage FT4

Question 11

Quel type d’immunoessais utilise le principe suivant :

Compétition entre l’analyte et un Ag couplé à une enzyme. Le signal est produit lorsque l’Ag couplé à une enzyme n’est pas lié par l’Ab.

Le signal est-il directement ou inversement proportionnel à la concentration de l’analyte?

Answer 11

EMIT : Enzyme-multiplied immunoassay technique

Signal directement proportionnel (plus il y a d’analyte, plus l’Ag* est libre, donc plus le signal est intense)

Question 12

Nommer les principales différences entre les méthodes de dosage EMIT, CEDIA et ELISA.

Answer 12

Points communs :

• EMIT, CEDIA et ELISA sont tous des immunoessais enzymatiques (EIA)
• Le signal mesuré est directement proportionnel pour tous ces types d’immunoessais. Cependant, les mécanismes de production du signal sont différents

Différences :

• ELISA :
  
  • Non-compétitif (sandwich)
  • Hétérogène
  • Enzyme liée à l’Ab de détection
  • Signal produit lorsque la sandwich est complète
• EMIT :
  
  • Compétitif
  • Homogène
  • Enzyme lié à un Ag
  • Signal produit lorsque l’Ag lié à l’enzyme est libre (non lié à un Ab)
• CEDIA :
  
  • Compétitif
  • Homogène
  • 2 fragments d’enzymes inactifs qui produisent une enzyme active lorsqu’ils sont reliés
    
    • 1 fragment est lié à un Ag
  • La liaison de l’Ab à l’Ag contenant le fragment d’enzyme empêche la formation de l’enzyme active

Question 13

Donner un exemple d’application courante pour chacun des types d’immunoessais suivant: ELISA, CEDIA, EMIT, LOCI, ECLIA

Answer 13

ELISA: Détection d’anticorps (Ex: varicelle, rubéole), calprotectine fécale, Ab anti-récepteur de phospholipase A2

CEDIA: drogues urinaires en général (Microgenics, Thermo Fisher)

EMIT: Amphétamines, metamphétamines (drogues urinaires en général)

LOCI: FT4, prolactine, TSH, … (Siemens)

ECLIA : Vitamine B12, T3L, cortisol, LH (Roche Elecsys)

Question 14

Décrire le phénomène d’excès d’antigène

Answer 14

Excès d’antigène = effet crochet

• Lorsque l’analyte est en trop grand concentration, que les Ab sont complètement saturés et que le signal produit est sous-estimé dû à la saturation du système de détection
• Résultat : faux négatif

Question 15

Comment les HAMA peuvent interférer dans un immunoessai?

Answer 15

• Les HAMA sont des Ab endogènes humain anti-souris développés à la suite d’une exposition à des Ag de souris
• Les HAMA peuvent reconnaitre les Ab de souris utilisés dans les immunoessais pour produire le système de détection
  
  • Affinité élevée et spécifique pour les Ab murins
  • Neutralisation des Ab de l’immunoessais
• Effet variable selon architecture de l’immunoessais
  
  • Non-compétitif (sandwich) : diminution du signal (Faux négatif)
  • Compétitif avec signal produit par un Ag* lié à l’Ab : diminution du signal (Faux négatif)
  • Compétitif avec signal produit par un Ag* libre : augmentation du signal (Faux positif)

Question 16

Décrire le principe, les avantages et désavantages de la néphélométrie?

Answer 16

Principe :

• Utilisation d’Ab liés à des billes de latex spécifiques pour l’analyte à doser
• Lorsque l’analyte est reconnu par les Ab, formation d’aggrégats
• Plus il y a d’aggrégats (turbidité), plus la lumière sera diffusée.
• Le signal provient de la mesure de la lumière diffusée à un angle de 90° (ou vers l’avant) par rapport au faisceau incident

(!) Méthode aussi disponible avec des Ag marqués avec des billes de latex. Principe d’inhibition de la turbidité (compétitif)

Question 17

Décrire les principes des dosages immunologiques compétitifs et de types « sandwich ».

Donner aussi un exemple de paramètre mesuré par chaque approche. (OCQ 2010)

Answer 17

Compétitif:

• Compétition entre un antigène marqué et l’analyte pour un anticorps spécifique
• Le signal est inversement proportionnel s’il provient de l’Ag lié ou directement proportionnel s’il provient de l’Ag libre
• Souvent utilisé pour les petites molécules (Ex: drogues dans les urines)
  
  • Ex: cocaïne urinaire, amphétamines, THC

Non-compétitif (sandwich) :

• Utilisation de 2 anticrops spécifiques pour l’analyte à doser : 1 Ab de détection et 1 Ab de capture
• Signal directement proportionnel à l’analyte
• Souvent utilisé pour les grosses molécules (Ex: protéines, peptides, hormones)
  
  • Prolactine, TSH, FSH, myoglobine, THIN

Question 18

Discuter de l’effet matrice

Answer 18

Interférant endogène qui interfère de façon non-spécifique

Ex: hémoglobine, bilirubine, lipides, paraprotéines

Question 19

Discuter de la réactivité croisée dans les immunoessais

Answer 19

Lorsque des molécules endogènes ou exogènes réagissent avec les composantes réactionnelles pour former un complexe Ag-Ab détectable qui s’apparente au complexe principal attendu (analyte-Ab)

Question 20

Discuter des interférences analytiques causées par les anticorps hétérophiles lors d’une analyse par immunoessais

Answer 20

Anticrops hétérophile :

• Ab humain endogène qui réagit avec les composantes réactionnelles de l’immunoessais
• Produit des résultats erronés
• Faux positif ou faux négatif en fonction de comment le signal est produit et des composantes neutralisées

Question 21

Vrai ou Faux : Les interférences causées par les anticorps hétérophiles sont retrouvées principalement lors des dosage de sang, sérum, plasma et urine.

Answer 21

FAUX

Beaucoup moins fréquent dans l’urine. Il faudrait un patient en insuffisance rénale terminale avec production d’Ab hétérophile pour observer cette interférence sur les échantillons d’urine. (Anecdotique!)

Question 22

Que sont les anticorps hétérophiles? (OCQ 2010)

Answer 22

Anticorps hétérophiles : Ab humains qui interagissent avec les composantes réactionnelles de l’immunoessais (Analyte, Ab ou Ag*).

Différents types d’Ab hétérophiles:

• Ab hétérophiles qui intéragissent de façon non spécifique et faiblement avec Ab de l’IE
• Auto-Ab vs l’analyte (spécifique)
• Ab anti-animal (interaction spécifique et forte avec Ab de l’IE)
• Macro-analyte, macro-enzyme
• Facteur rhumatoïde

Question 23

D’où proviennent les anticorps hétérophiles? (OCQ 2010)

Answer 23

Des anticorps hétérophiles peuvent apparaître chez un patient en réponse à une exposition à certains animaux ou produits animaux (Ex: Tx avec Ab), ou à une infection par des agents bactériens ou viraux, ou de manière non spécifique (Ex: maladie auto-immune).

Différents types d’Ab hétérophiles:

• Ab hétérophiles qui intéragissent de façon non spécifique et faiblement avec Ab de l’IE
• Auto-Ab vs l’analyte (spécifique)
• Ab anti-animal (interaction spécifique et forte avec Ab de l’IE)
• Macro-analyte, macro-enzyme
• Facteur rhumatoïde

Question 24

Pourquoi les HAMA sont-ils aussi répendus ?

Answer 24

À cause de l’utilisation fréquente d’Ab monoclonaux de souris dans le cardre de thérapie ou d’imagerie

Question 25

Vrai ou Faux : Les HAMA sont une source d’interférence plus courante pour les immunoessais compétitifs que pour les non-compétitifs

Answer 25

FAUX

Plus fréquent pour les IE non-compétitifs (2x plus d’Ab dans ce types d’IE)

Question 26

Comment les anticorps hétérophiles peuvent-ils influencer les résultats des immunoessais compétitifs et des immunoessais de type « sandwich ». (OCQ 2010)

Answer 26

Les Ab hétérophiles vont causer des interférences s’ils ont suffisament d’affinité pour les composantes réactionnelles de l’immunoessais (Analyte, Ag, Ab(s))

Les Ab hétérophiles auront un effet différent selon l’architecture du test et selon quelle composante est reconnue par l’Ab hétérophile. Il faut analyser au cas par cas.

Mécanisme de liaison principal : se lient à la région Fc des Ab de l’IE

Exemple d’interférence possible:

• Pour un IE “sandwich”, l’Ab hétérophile peut mener à la formation de la sandwich sans que l’analyte soit présent
• Si l’Ab hétérophile lie/neutralise un Ab dans un IE où le signal est directement proportionnel : Cause Faux négatif
• Pour un IE compétitif, si l’Ab hétérophile lie l’analyte/Ag, l’effet dépend de la nature de l’Ag compétitif utilisé (analogue ou même molécule) et du système de production du signal (signal produit lorsque l’Ag* est lié à un Ab ou libre)
• (…)

Question 27

Nommer un cas particulier d’interférence par les anticorps hétérophiles lors du dosage immunologique des hormones thyroïdiennes

Answer 27

Il est fréquent qu’un Ab hétérophile cause un Faux Positif pour le dosage de la TSH (sandwich) et un Faux Négatif pour le dosage des hormones thyroïdiennes libres (compétitif)

Question 28

Discuter de l’interférence analytiques des facteurs rhumatoïdes sur les immunoessais

Answer 28

Facteur rhumatoïde:

• IgM qui interagit avec le fragment Fc des Ab
• Présent chez > 70% des patients souffrant d’arthrite rhumatoïde
• Augmente lors d’une infection
• Mécanisme d’interférence:
  
  • IE sandwich : le facteur rhumatoïde fait le pont entre les 2 Ab de l’immunoessais. Cause un Faux positif
  • IE compétitif : Le facteur rhumatoïde neutralise les Ab de détection. Effet dépend de comment le signal est généré (par Ag* libre ou lié)

Question 29

Discuter de l’interférence par les auto-anticorps sur les immunoessais

Answer 29

Auto-anticorps:

• Se lient à l’analyte ou à une composante réactionnelle de l’immunoessais (Ag* ou Ab)
• Fréquemment observés chez les patients atteints de maladies auto-immunes
• Effet dépendant de la composante ciblée et du mécanisme de production du signal

Question 30

Discuter de l’interférence analytique des anticorps humain anti-animaux en immunoessais (origine, spécificité, affinité, mécanisme, élimination)

Answer 30

HAAA : Anticorps humains anti-animaux

• Ab spécifiques à certaines espèces
• Affinité plus grande que les Ab hétérophiles
• L’abondance et la durée des HAMA sont très variables
  
  • Quantité peut varier de µg/L à g/L
  • Apparition autant transitionnelle (qq jours) que pouvant durer des mois/années
• Mécanisme : reconnaissent majoritairement la région Fc des Ab de la méthode (neutralisation des Ab)
• Les plus fréquent sont les Ab humain anti-souris (HAMA)

Origine:

• Ab développés suite à :
  
  • Exposition à des animaux
  • Vaccin générés chez les animaux (souvent lapin ou poulet)
  • Traitement utilisant des Ab de souris ou de rat : Ab d’imagerie ou Ab thérapeutiques
  • Transfert d’Ag alimentaires à travers la paroi intestinale chez certaines personnes (Ex: maladie coeliaque)

Élimination :

• Certains kit commerciaux sont disponibles pour identifier les HAMA, mais étant donné la diversité des Ab pouvant être produits, un résultat négatif avec ces kits ne garanti pas qu’il n’y a pas de HAMA
• Agents bloquants spécifiques et non-spécifiques existent pour limiter les interférences

Question 31

Quelle est la principale différence entre le principe de mesure de la turbidimétrie et de la néphélémétrie

Answer 31

La néphélémétrie détecte la lumière diffusée (à angle droit ou vers l’avant) et la turbidimétrie mesure une réduction de la lumière transmise vers l’avant.

Le détecteur est donc placé dans l’axe du faisceau incident pour une mesure en turbidimétrie, alors qu’il est placé à angle en néphélémétrie

Question 32

Comment le pré-analytique peut interférer sur les dosages en immunoessais?

Answer 32

• Composantes matérielles des tubes peuvent interférer sur les liaison Ag-Ab (Ex : parois de plastique)
• Volume du prélèvement inadéquat : Héparine peut affecter liaison Ag-Ab
• Hémolyse : relargage de protéases qui peuvent dégrader les protéines à doser (insuline, glucagon, calcitonine, PTH, ACTH, gastrine)
• Lipémie peut interférer avec les systèmes de détection de la turbidimétrie et de la néphélométrie
• Acides gras non-estérifiés peuvent interférer avec le dosage des molécules hydrophobes (Ex : stéroïdes)

Question 33

Quelles sont les limites de la turbidimétrie/néphélémétrie?

Answer 33

Sujets aux interférences suivantes:

• Excès d’antigène : Effet crochet
• Effet matrice : lipémie cause de la turbidité
  
  • Augmentation du signal “background”
  • Mesure de la cinétique du signal plutôt qu’un signal ponctuel permet de limiter l’interférence de la matrice

Question 34

Quel est le principe de la FPIA?

Answer 34

FPIA : Fluorescence polarization immunoassay

• Immunoessais homogène compétitif
• Utilisation d’un Ag couplé à une molécule fluorescente (fluorescéine)
• Mesure de la fluorescence polarisée
  
  • Polarisation de la fluorescence lorsque l’Ag est lié à l’Ab
  • Fluorescence non-polarisée lorsque l’Ag est libre
• Signal inversement proportionnel à la concentration d’analyte
• Méthode largement utilisée pour le dosage des Rx et des drogues
• Longueur d’onde d’excitation et d’émission différente

Question 35

Discuter des interférences par la biotine

Answer 35

• La biotine est impliquée dans différents types d’immunoessais, mais les plus fréquents sont les IE de type ECLIA (Roche) et LOCI (Siemens).
• Roche est plus sensible aux interférences par la biotine que Siemens
• Indication des suppléments de biotine :
  
  • Tx expérimental phase 3 pour la sclérose en plaque (300 mg/jour)
  • Tx d’une maladie “erreur innée du métabolisme” : 10-20 mg/jour
    
    • Déficit en biotinidase
    • Déficit en holocarboxylase synthétase
  • Suppléments en vente libre : comprimés jusqu’à 10 mg
    
    • Centrum : Concentration de l’ordre du µg
• Selon la FDA, les cliniciens ont la responsabilité de demander à leurs patients s’ils prennent des suppléments de biotine
• En cas de prise de biotine, un prélèvement 8h post-dose suffit généralement à éliminer l’interférence par la biotine (dose de 10 mg : < 30 ng/mL après 8h)
  
  • En supposant que l’excrétion rénale est normale
• Mécanisme d’action de l’interférence par la biotine : La biotine libre lie les particules couplées à la strepravidine, inhibant ainsi la formation du système de détection de l’immunoessais dépendant de la liaison biotine-streptavidine
  
  • Interférence négative lorsque le signal est directement proportionnel à la concentration de l’analyse
• Analytes les plus touchées par ce type d’interférence :
  
  • Troponine T de Roche
  • Hormones stéroïdiennes

Question 36

Quelle est la différence entre des anticorps anti-idiotypiques et anti-isotypique?

Answer 36

Les anticorps anti-idiotypiques sont dirigés contre la région hypervariable (Fab) de la molécule d’Ig, et les anticorps anti-isotypiques sont dirigés contre les régions constantes (Fc)