Spectrométrie de masse Flashcards
Quel est l’impact du type de chromatographie (i.e. gazeuse versus liquide) sur la détection par spectrométrie de masse?
La dérivation des analytes modifie le ratio m/z filtré en Q1
Les gaz ionisent mieux, par impact électronique ou ionisation chimique, et ces modes d’ionisation produisent beaucoup de fragments.
Les liquides doivent être volatilisés avant l’ionisation par : électrospray, Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI) ou Photo-Ionisation (APPI)
L’ionisation par impact électronique : les substances passent dans un faisceau dense d’électrons standardisé à ___ eV.
Cela mène à une ionisation ______ (positive ou négative?).
L’énergie distribuée en énergie vibrationnelle et les liens les plus faibles se brisent en premier. Les patrons de fragmentation reproductibles peuvent être recherchés dans les banques spectrales.
70 eV
ionisation positive
Dessiner le schéma de l’impact électronique
Identifier l’échantillon entrant dans le port, bloqué par un repeller, la cathode du même côté que l’aimant N, l’anode avec l’aimant S,
Donner des exemples de gaz réactif pour l’ionisation chimique
méthane, propane, isobutane, hydrogène
Dessiner l’ionisation chimique
Dans l’analyse des acides organiques, le LC-MS a une spécificité ______ à celle du GC-MS.
inférieure
Décrire les étapes d’ionisation par ESI
Nébulisation par sortie d’une aiguille avec 4-5 kV de potentiel
Gaz axial aidant nébulisation
Gouttelettes chargées
Évaporation
Désolvatation
L’electrospray ionisation (ESI) permet l’ionisation ____ (positive/négative?)
positive ou négative
(Les lipides s’ionisent négativement à cause des acides carboxyliques)
Quel est ce scan mode?
Quel est ce scan mode?
Quel est ce scan mode?
Precursor ion scan : On scan en Q1 tous les composés pouvant donner une Product Ion de m/z prédéfini en Q3.
C’est l’inverse du Product Ion scan, où on fixe en Q1 et balaie en Q3.
Quel est ce scan mode?
Constant neutral loss scan : On balaie en Q1 tous les precursor ions et en Q3 tous les Product Ions, mais avec un décalage (offset) de m/z entre Q1 et Q3 correspondant à une perte neutre prédéfinie lors de la collision en Q2.
Qu’est-ce que ça mange en hiver, la déconvolution en spectrométrie de masse?
Les molécules ont un patron isotopique secondaire à la distribution naturelles d’isotopes. Une molécule plus grosse contient plus d’atomes et a une probabilité augmentée d’avoir une masse augmentée. Cela apparaît alors comme plusieurs ratios m/z pour cette même molécule (ou ses fragments). Il faut déconvoluer ces pics afin de calculer l’intensité de signal totale.
Comment peut-on solutionner le problème de la suppression d’ions en ESI?
Augmenter le % B pour faciliter l’évaporation.
Diminuer le débit (< 1 ou
Choisir un solvant B avec meilleure capacité d’ionisation
Améliorer la séparation si un composé co-éluant semble impliqué.
Donner trois exemples de dosages effectués par LC-MS en laboratoire clinique
immunosuppresseurs,
amines biogéniques,
25(OH)-vitamine D,
antirétroviraux,
drogues psychoactives,
acide méthylmalonique,
hormones thyroïdiennes,
stéroides, etc
Par quelle méthode sont mesurés les acylcarnitines?
Dérivation en ester butylé et ESI en mode Product Ions : le Q3 est fixé sur 85 m/z et le Q1 balaie les ratios. Le chromatogramme contient ainsi tout ion précurseur produisant un fragment 85 en Q3.
Les quadripôles filtrent les masses. Expliquez ce graphique.
Ce graphique explique la relation entre le voltage RF et le voltage DC, permettant la sélection d’une intervalle m/z précise
Quelle est la source recommandée pour les molécules de petite taille (< 1000 Da) et non-polaires?
APPI et dans une moindre mesure APCI
(BCMslide 254)
Quel est le nom de la méthode dans laquelle l’analyte est mélangé à une matrice sur plaque qui, excitée par un laser pulsé, se résorbe avec l’analyte qui est alors ionisé?
MALDI, habituellement analysé par TOF
Nommer quelques molécules contaminantes pouvant causer de la suppression d’ions
Sels non volatils
Agents de pairage ionique
Métabolites endogènes
Médicaments
Composants de la matrice biologique
Nommer deux mécanismes causals de la suppression d’ions
Précipitation ou co-précipitation
Évaporation incomplète de la gouttelette
Éjection de la gouttelette sous forme neutre
Neutralisation ou transfert de charge en phase gazeuse
Décrire les deux méthodes d’évaluation de la suppression d’ions
Ajouts dosés pour l’ampleur de la suppression : comparer la réponse (signal) du MS pour les analytes ajoutés dans des extraits de matrice versus eau (ou solvent)
Infusion post-colonne pour localisation temporelle de la supression d’ions : infusion constante de l’analyte (via une seringue et T) et injection d’un échantillon ne contenant pas l’analyte.
Vous avez un problème de suppression d’ions avec un analyte. Que faites-vous?
Évaluer le pré-traitement des échantillons pour en obtenir de plus propres
Optimiser la chromatographie pour s’éloigner des régions de suppression ionique
Compenser avec un standard interne deutéré
Comment le Total Ion Chromatogram est-il affecté par le choix de scan mode d’une analyse (Full Scan, SIM ou MRM)?
Le Total Ion Chromatogram représente en un graphique tous les ions mesurés par le MS dans cette analyse, donc filtrer par une plage de m/z réduite (Scan) ou un filtre d’ion précurseur (SIM) ou transition (MRM) limite le nombre de molécules visibles tout en augmentant la fréquence des mesures pour ces plages.
Définir le Collision Energy
C’est la différence de potentiel entre l’entrée et la sortie de la cellule du Q2. Une valeur élevée augmente la fragmentation.
Quelle est l’utilité d’une trappe ionique?
Quantification et caractérisation des fragments via une fragmentations successives si suffisamment abondants
Quel est l’avantage d’une trappe ionique linéaire?
Accumuler des ions avant la détection afin d’améliorer la sensibilité
Quels sont les avantages et désavantages principaux du TOF?
Avantage : doser des analytes de grand poids moléculaire (protéines, etc) avec grande résolution
Désavantage : le dwell time entre les ions entre le laser et le détecteur limite la fréquence d’échantillonage
Nommer les différents types de MS (analyseur de masse) (4). Lequel est le plus utilisé en clinique?
- Quadripôle
- TOF (time of flight)
- Trappe ionique
- Secteur électromagnétique
Le quadripôle est le plus utilisé en clinique
Quels types d’analyseurs de masse peuvent être combinés pour faire de la MS en tandem (3)? Lequel possède une meilleure résolution?
- QQQ (triple quad) ou QqQ (ou 2 quad et une cellule de collision)
- Q-trap
- Q-TOF
Le Q-TOF a une résolution plus élevée (10 000 vs 5000 pour QQQ et 6000 pour Q-trap)
Quel est l’avantage principal de la MS en tandem?
Moins d’interférences potentielles (meilleure spécificité)
Est-ce que le standard interne permet de toujours corriger pour la suppression d’ion?
NON
Le SI permet uniquement de corriger pour la suppression d’ion s’il co-élue avec la molécule d’intérêt (ionisation au même moment). La variation de la composition de la phrase mobile et des autres molécules présentes au moment de l’ionisation peut contribuer différemment à la suppression d’ion.
Dans quel état l’échantillon doit-il être pour qu’il puisse être analysé en MS (2)?
État gazeux et ionisé
Quelle composante endogène de la matrice sanguine est bien connue pour interférer avec le processus d’ionisation en MS?
Les lipides (majoritairement les phospholipides)
Qu’est-ce qu’un composé isobare? Donner un exemple
Un composé ayant la même masse d’ion précurseur et qui partage un fragment de même masse que l’analyte d’intérêt.
Potentielle interférence Ex: un médicament et ses métabolites peuvent être isobares avec l’analyte d’intérêt; les stéroïdes
Quel(s) type(s) de marquage isotopique (2H, 13C, 15N) est-il préférable de choisir pour les standards internes? Pourquoi?
Préférable d’utiliser 13C et 15N.
Raisons:
- Les molécules marquées avec 2H peuvent se comporter différemment lors de la chromatographie (shift de temps de rétention)
- Le marquage peut être perdu à cause d’échange avec l’hydrogène
Que signifie l’acronyme MALDI-TOF?
Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization - Time of Flight
En français… Spectrométrie de masse en temps de vol après désorption-ionisation laser assistée par matrice
Nommer une configuration d’instrument utilisée pendant le développement de méthode qui permet entre autre d’évaluer la suppression ionique selon l’effet de la matrice. Décrire brièvement ce mode/cette configuration.
Postcolumn Infusion (PCI)
Analyte pur injecté en continu après la colonne HPLC, avant la source d’ionisation. Injection et chromatographie normale de la matrice dépourvue d’analyte (en comparaison avec injection en continu d’un blanc)
Décrivez le rôle du standard interne dans les analyses chromatographiques quantitatives des médicaments dans le sérum. (OCQ clin 2005 A9)
Le standard interne corrige pour :
- Le rendement d’extraction
- La suppression d’ions
- Les erreurs de pipetage (après ajout du SI)
- Les variations du volume d’injection
- Les variations légères des conditions de chromatogaphie
- La sensibilité des détecteurs
Combien de calibrateurs sont minimalement requis pour produire la courbe de calibration en MS (CLSI)?
Minimum 6 qui ne sont pas égal à 0
Quelle transition précurseur->fragment doit-on éviter de choisir à tout prix ?
Une transition qui correspond à la perte de molécule d’eau (∆18 m/z)
Quels sont les critères de validation d’une méthode MS (CV et biais) (CLSI)?
Biais et CV < 15%
LLMI : CV <20% et Biais <15%
Quels sont les avantages et les inconvénients de la MS p/r aux immunoessais?
Avantages:
- Possibilité de quantifier plusieurs analytes en même temps
- Plus spécifique que les immunoessais
- Moins cher (coût par test)
Inconvénients:
- Coût d’implantation plus élevé
- Technique manuelle (expertise technique élevée)
- Complexité du système (contrat d’entretien)
Quel est le principal désavantage relié à l’utilisation de “kit” pour la MS?
Grande variabilité inter-lot
Quel standard interne est habituellement utilisé pour le dosage du tacrolimus?
Ascomycine
Qu’est-ce que le mode SIM?
SIM : Selected Ion Monitoring
Le mode SIM fait référence au fait de sélectionner une seule masse ou une ensemble défini de masse à l’aide d’un analyseur de masse (quadripôle).
Mode applicable en MS et MS en tandem
Comment peut-on identifier une interférence en MS/MS?
Une interférence positive peut être évaluée en regardant le ratio des ions quantifiant/qualifiant (Ex: molécule isobare)
Une interférence négative peut être évaluée en regardant le signal du standard interne en cas de suppression d’ion ou avec le temps de rétention (ou SI) en cas d’interférence chromatographique
Vrai ou Faux : Un désavantage important des sources ESI est qu’elles produisent des ionisations multiples et qu’elles fragmentent l’analyte à doser.
FAUX
- La capacité d’ionisation multiple est ESI est un AVANTAGE (détection de macromolécules commes les protéines)
- Les ESI sont des sources d’ionisation “soft”, donc qui ne fragmentent pas ou très peu lors de l’ionisation
Énumérer différents paramètres à mettre au point lors du développement d’une méthode LC-MS/MS
- Type de colonne HPLC
- Phase mobile
- Paramètres de la chromatographie
- Paramètres de la source d’ionisation (T°, débit de gaz, pression du gaz, voltage de l’aiguille, débit LC)
- Masse de l’ion précurseur
- Fragmentation (voltage cellule de collision)
- Sélection des ions fragments (transitions)
- Extransction/pré-traitement de l’échantillon
- Validation de la méthode (incluant suppression d’ions et rendement d’extraction)
Vrai ou Faux : L’ionisation avec une source ESI s’effectue à pression atmosphérique
VRAI
Comment choisi-t-on les ions qualifiant et quantifiant?
Choix basé sur leur spécificité et leur intensité.
Quantifiant : le plus intense
Qualifiant : le 2e plus intense
Quelles sont les limites de la LC-MS/MS ?
- Composé doit être ionisable et volatil
- Transitions propres à l’analyte d’intérêt
- Séparation chromatographique (molécules isobariques et composantes de la matrice qui peuvent causer de la suppression d’ion)
- Suppression d’ion
- Méthode manuelle (CV analytique n’est pas aussi constant et aussi faible que si on a seulement des sources d’erreurs provenant de l’appareil)
- Appareils et protocoles non standardisés (Importance des CQ externe)
Expliquez pourquoi une colonne SPE (en mode online) n’est pas considéré comme une pré-colonne
Par définition, une pré-colonne est composée de la même phase stationnaire que la colonne analytique. La pré-colonne sert donc à protéger la colonne analytique en évitant de la surcharger inutilement avec des composés non essentiels au dosage. Une SPE est plutôt considérée comme une chromatographie préparatoire
Selon les CLSI, quel critère de S/N est requis pour valider une méthode LC-MS/MS?
Un S/N idéal >20; S/N minimal de 10
Selon le CLSI, quel critère doit être respecté concernant le carryover?
Le carryover doit est <25% la valeur de la LLMI lorsqu’on passe un échantillon négatif
Nommer un avantage de la LC-MS/MS par rapport à la LC-MS
MS en tandem permet de sélectionner l’analyte et d’être donc moins stricte sur les conditions chromatographiques étant donné que la transition observée est caractéristique à l’analyte. Temps de rétention plus court. Toutefois, un minimum de rétention est nécessaire pour minimiser la suppression d’ions et les inteférences de molécules isobariques
Décrire bièvement le fonctionnement d’un détecteur MS
l’analyte d’intérêt est ionisé dans la source d’ionisation, sélectionné par l’analyseur de masse selon son ratio M/Z (masse/charge) puis détecté par un amplificateur d’électron. Résultats présentés sur un chromatogramme avec abondance relative de l’ion M/Z en fonction du temps
Décrire la différence entre les modes Product ion scan et Precursor ion scan en LC-MS/MS
Product ion scan (ou daughter ion scan) :
Q1 : Sélection d’une m/z pour l’ion précurseur
Q2 : Fragmentation
Q3 : Scan de tous les fragments produits
Precursor ion scan (ou parent ion scan) :
Q1 : Scan de tous les ions précurseurs
Q2 : Fragmentation
Q3 : Sélection d’une m/z pour les fragments produits
* Application typique : Acylcarnitines
Décrire la différence entre les modes SRM et MRM en LC-MS/MS
SRM : Single reaction monitoring
Analyse d’une seule transition de masse (1 m/z sélectionné en Q1 et 1 m/z sélectionné en Q3)
MRM : Multiple reaction monitoring
Analyse de plus d’une transition de masse (>1 m/z sélectionné en Q1 et/ou >1 m/z sélectionné en Q3)
Quelles sont les caractéristiques d’un bon standard interne?
- Chimiquement comparable à l’analyte
- Pas présent dans l’échantillon à analyser
- Réagit de la même façon aux variations analytiques que la molécule à doser
- Doit être “séparable”/distinguable de l’analyte (masse en MS)
Décrire brièvement comment un quadripôle peut effectuer une sélection de masse
Sépare les ions en fonction de la stabilité de leur trajectoire dans un champ électrique oscillant
- Un quadripôle est composé de 4 “rods” (2 positives et 2 négatives) chacune ayant un courant continu et un courant alternatif (radio-fréquence).
- Les gros ions sont davantage influencés par le courant continu que par la radio-fréquence.
- Les petits ions sont davantage influencés par la radio-fréquence que les gros ions.
- Les ions dont la trajectoire sera stabilisée se renderont au détecteur (sortiront du quad)
Exemple d’analyse d’ions positifs:
- Rod négatives : Filtre passe bas
- Le courant continu attire les ions positifs vers les rods.
- La radio-fréquence appliquée modifie plus facilement la trajectoire des petits ions. Les gros ions finiront par être éliminés à cause du courant continu qui les attire vers les rod. Les petits ions répondent au courant alternatif et modifient leur trajectoire en conséquence, leur permettant ainsi de sortir du quadripôle si leur trajectoire est suffisamment mofifiée par la RF
- Rod positives: Filtre passe haut
- Le courant continu positif repousse les ions positifs vers le centre du quadripôle.
- La trajectoire des petits ions est plus sensible à la radio-fréquence que les ions avec une m/z élevée. La trajectoire des gros ions leur permet donc de sortir du quadripôle, alors que les plus petits ions seront perdus en conséquence de la RF.
Discuter des limites du MALDI-TOF
- MALDI (principe d’ionisation) :
- Bruit de fond élevé et CV plus élevé pour l’ionisation
- Mycobactéries : Difficile de libérer les protéines. Nécessite un prétraitement d’échantillon particulier
- Nombre minimal de bactérie pour permettre la détection (ça prend une colonie : >105 bactéries)
- Échantillons provenant de culture de sang moins efficace que si on utilise directement une colonie
- Temps d’analyse plus long (30-40 minutes vs 5-6 minutes)
- Moins bon % d’identification (mais résultats valide)
- Utilisation de certaines géloses pour faire pousser les bactéries peut mener à de faibles scores ou % de confiance
- Colonies très petites difficiles à identifier
- Requiert l’utilisation de colonie isolée : 1 seul type de bactérie, sinon ID échoue
- Certaines bactéries sont difficiles à différencier (Ex: E. coli et Shigella spp)
Décrire brièvement le principe de l’ICP-MS
- ICP : Ionisation de l’échantillon par une torche à plasma (T° = 6000-10000 °C). Production d’atomes neutres ou ionisés
- MS : Sélection des ions selon leur m/z (quadripôle)
- Identification des éléments basée sur la présence des isotopes individuels ou ratio entre les isotopes (abondance)
(!) On regade des éléments/atomes, pas des molécules comme en spectrométrie de masse
