Chromatographie

Question 1

Nomme 3 Dés/Avantages de la chromatographie par rapport au immunoessaies.

Answer 1

Avantages:

• Plusieur analytes sur même échantillons
• Réactifs pas cher
• Adaptable pr nouveau dosage

Désavantage:

• Plus long
• Appareils complexe et couteux
• Entrainement spécial des techs

Question 2

Qu’est-ce que la chromatographie?

Answer 2

La chromatographie est une méthode dans laquelle les composants d’un mélange sont séparés en fonction de leurs interactions différentielles avec deux phases chimiques ou physiques: une phase mobile et une phase stationnaire

Question 3

Qu’est-ce qu’un plateau théorique?

Answer 3

C’est la zone requise pour qu’une substance s’équilibre entre la phase mobile et la phase stationnaire

Question 4

Qu’est-ce que le facteur de rétention (k)?

Comment est-il calculé?

Answer 4

Temps qu’une substance passe dans la phase stationnaire versus le temps passé dans la phase mobile

Calcul : k = (tR-tM)/tM

tR = temps de rétention

tM = temps mort

Question 5

Qu’est-ce que la sélectivité (alpha) en chromatographie?

Comment est-elle calculée

Answer 5

La sélectivité est la différence d’affinité de 2 substrats pour la phase stationnaire

Calcul : a= kB/kA

Question 6

Qu’est-ce qui détermine la sélectivité et le facteur de rétention en chromatographie (3)?

Answer 6

• Les composés qui sont séparés
• La phase stationnaire
• La phase mobile

Question 7

Comment le nombre de plateaux théoriques influence-t-il l’efficacité de la colonne? Et la hauteur?

Answer 7

Plus le nombre de plateaux théoriques (N) augmente, plus l’efficacité augmente

Plus la hauteur des plateaux théoriques (H) diminue, plus l’efficacité augmente

Question 8

Que veut-on dire quand on parle de hauteur de plateau théorique (H)?

Answer 8

On fait référence à la longueur (distance à parcourir) requise dans la colonne pour que l’équilibre entre la phase stationnaire et la phase mobile ait lieu.

Plus H est élevé, plus le composé doit parcourir une grande distance dans la colonne pour s’équilibrer.

Question 9

Comment peut-on calculer le nombre de plateau théorique d’une colonne à partir d’un chromatogramme?

Answer 9

N = 16(t_R/W_b)² OU N = 5,545 (t_R/W_h)²

t_R = temps de rétention

W_b = largeur du pic à la base

W_h = largeur du pic à mi-hauteur

Question 10

Écrire l’équation de van Deemter. Définir chacun des termes de l’équation

Answer 10

H = A + B/µ + Cµ

µ = débit

A = Diffusion d’eddy

B = Diffusion longitudinale

C = Transfert de masse (phase mobile et phase stationnaire)

Question 11

Qu’est-ce que la résolution (Rs) en chromatographie? Comment se calcule-t-elle?

Answer 11

Représente la capacité à séparer convenablement 2 substances

Rs = 2 (t_RB-t_RA)/(W_bA+W_bB)

Question 12

Quels facteurs chromatographiques affectent la résolution des pics (3)?

Answer 12

Rs augmente si :

• Nombre de plateaux théoriques augmente
• La sélectivité augmente
• Le facteur de rétention augmente

Question 14

Vrai ou Faux : La résolution idéale est > 0,8, puisqu’une résolution de > 0,8 permet la séparation des pics par atteinte de la ligne de base.

Answer 14

FAUX :

• La résolution idéale** est **> 2
• Une résolution > 1,25** permet la séparation par atteinte de la **ligne de base
• Une résolution de > 0,8** est la résolution **minimale pour quantifier 2 pics symétriques de même hauteur

Question 15

Quelle est la différence entre une quantificaiton externe et une quantification interne en chromatographie?

Answer 15

Quantification externe : Concentration de l’analyte déterminée en fonction de l’aire du pic de l’analyte

Quantification interne : Utilisation d’un standard interne pour normaliser la quantification (Concentration déterminée en fonction du ratio de l’air des pics de l’analyte / SI)

Question 16

Identifier les 2 modes d’injection en A et B.

À quel type de chromatographique appartiennent ces types d’injection?

Answer 16

A : Mode Split

B : Mode Splitless

Chromatographie gazeuse

Question 17

Qu’est-ce que le septum en GC?

Answer 17

Sert d’interface entre l’injecteur et le système chromatographique

Consommable qui doit être changé et qui peut affecter la qualité de l’injection

Question 19

2 types de colonnes sont utilisés en GC. Lesquelles et qu’elle est la différence?

Answer 19

Colonnes garnies (packed) : tube métallique rempli de phase stationnaire, moins efficaces, utiles lorsqu’une grande quantité d’échantillon est requise

Colonnes capillaires : Capillaire de silice avec revêtement de phase stationnaire (faible épaisseur), plus efficace et meilleure résolution. Colonnes les plus utilisées

Question 20

Quel paramètre est le plus important en GC pour optimiser l’efficacité de la chromatographie:

A - La phase stationnaire

B - La température

C - La phase mobile

D - Le débit

Answer 20

B - La température

Le contrôle précis des températures de la colonne et de l’injecteur est nécessaire pour obtenir des performances optimales et des résultats fiables dans un système GC.

Conditionnement thermique des colonnes avant leur première utilisation.

Question 21

Nommer 4 types de détecteurs utilisés en GC. Lequel est le plus sensible? Lequel est le plus utilisé?

Answer 21

• FID : Détecteur à ionisation de flamme
• NPD : détecteur thermo-ionique
• ECD : DÉtecteur à capture d’électrons
• MS : Spectromètre de masse

Le plus sensible : ECD

Le plus utilisè : FID

Question 22

Quel est le principe de détection d’un détecteur FID ?

Answer 22

Détecteur à ionisation de flamme : Détecteur de masse utilisé en GC

1. Composés élués mélangés avec H2 et brûlés par une flamme entourée d’air et d’O2.
2. Faible proportion de molécules brulées libère des électrons.
3. Courant généré est mesuré. Réponse proportionnelle au nombre de carbone

Question 23

Quel est le principe de détection d’un détecteur NPD?

Answer 23

Détecteur thermo-ionique :Reconnaît sélectivement l’azote et le phosphore. Détecteur de masse utilisé en GC.

1. Composés élués mélangés avec H2 et brûlés par une flamme entourée d’air et d’O2 (comme FID)
2. Utilisation d’une bille de métal alcalin chauffée (Rubidium ou chlorure de césium) qui émet des électrons (courant de base).
3. Les composés azotés et phosphorés partiellement brûlés sont adsorbés à la surface de la bille, ce qui augmente l’émission d’électrons
4. Courant généré mesuré.

Question 24

Nommer les différents types de chromatographie liquide (5)

Answer 24

1. Chromatographie d’affinité
2. Chromatographie d’exclusion de taille
3. Chromatographie d’adsorption
4. Chromatographie échangeuse d’ions
5. Chromatographie de partage

Question 25

Vrai ou Faux : En chromatographie d’absorption, la force éluotropique de la phase mobile fait référence à la capacité de liaison au support solide. Ainsi, plus la force éluotropique d’une phase mobile est élevée, plus son pouvoir d’élution est important.

Answer 25

VRAI

Question 26

Quel est le principe de rétention de la chromatographie d’adsorption?

Answer 26

Principe de rétention : compétition entre l’analyte et la phase mobile pour lier le support solide (les 2 peuvent adhérer au support solide). Composés séparés en fonction de leur adsorption/désorption à un support solide

Question 27

Quel est le principe de rétention de la chromatographie de partage/partition?

Answer 27

Les composés sont séparés en fonction de leur partage/partition entre une phase mobile liquide et une phase stationnaire qui est enduite (coated) ou liée (bound) sur un support solide

Question 28

Compléter la phrase :

En chromatographie de partition en phase , les composés ont une meilleure rétention étant donné que la phase stationnaire est hydrophobe

Answer 28

En chromatographie de partition en phase inverse**, les composés **hydrophobes ont une meilleure rétention étant donné que la phase stationnaire est hydrophobe

Question 29

Qu’est-ce que la chromatographie par paires d’ions (IPC : ion pair chromatography) ?

Answer 29

Chromatographie liquide à mode mixte: Chromatographie en phase inverse qui a la capacité à séparer les composés ioniques en fonction de leur charge.

Applications : Catécholamines, Rx, acides nucléiques

Question 30

Quelle composante de la colonne dont la phrase stationnaire est liée à la silice peut engendrer un problème de chromatographie (double principe de rétention) ?

Answer 30

Les silanols libres (surtout colonnes C18; encombrement stérique)

Question 31

Compléter la phrase :

Les colonnes échangeuses de cations possèdent une phase stationnaire composée de groupements ioniques chargés . La chromatographie permet donc de séparer les ions .

Answer 31

Les colonnes échangeuses de cations possèdent une phase stationnaire composée de groupements ioniques chargés négativement**. La chromatographie permet donc de séparer les ions **positifs (cations)

Question 32

En chromatographie échangeuse d’ions, la rétention est affectée par (4) :

Answer 32

Rétention affectée par :

(1) Le pH,
(2) Le type d’ions concurrents utilisés
(3) Le type de charges fixes utilisées comme phase stationnaire
(4) La densité de ces charges fixes sur le support

Question 33

Nommer une phase mobile forte et une phase mobile faible à utiliser en chromatographie de partage en phase normale

Answer 33

Phase mobile faible : hydrophobe

Phase mobile forte : polaire (index polarité élevé) (Ex : eau, MeOH)

Question 34

Nommer une phase mobile forte et une phase mobile faible à utiliser en chromatographie de phase inverse

Answer 34

PM forte : Moins polaire que l’eau (Ex: acétonitrile)

PM faible : Polaire (Ex: eau, MeOH)

Question 35

Nommer une phase mobile forte et une phase mobile faible à utiliser en chromatographie d’exclusion de taille

Answer 35

N/A. Pas de phase mobile faible ou forte étant donné que le principe de rétention est basé sur les propriétés physiques et non sur les interactions chimiques.

Question 36

Quelle est la différence entre une chromatographiede filtration sur gel et une chromatographie par perméation de gel?

Answer 36

Filtration sur gel : lorsque phase mobile = eau ou phase aqueuse (souvent avec un support à base de carbohydrate ou de polyacrylamide)

Chromatographie par perméation de gel : Lorsque phase mobile = phase organique (souvent avec support de polystyrène).

Question 37

Quel type de chromatographie utilise le boronate dans la composition de sa phase stationnaire? Nommer une application importante de ce type de chromatographie

Answer 37

Chromatographie d’affinité de Boronate : Application clinique pour l’analyse de HbA1c

Question 38

Nommer 3 types de détecteurs utilisés en chromatographie liquide

Answer 38

1. Spectromètre de masse
2. Détecteur d’absorbance
3. Détecteur de fluorescence

Question 39

Qu’est-ce que la chromatographie HILIC?

Answer 39

HILIC : Hydrophilic interaction liquid chromatography

Phase stationnaire polaire : Contient une couche plus polaire enrichie en eau qui est à la surface ou près de la surface d’un support polaire

Question 40

Donner un exemple de type de chromatographie planaire (de surface)

Answer 40

Chromatographie sur couche mince (TLC)

Question 41

Quel est le principe des techniques d’extraction en phase solide? Quelle est leur application principale en biochimie clinique?

Answer 41

SPE : Solid-phase extraction

Un analyte contenu dans une phase liquide entre en contact avec une phase solide (particules sorbantes dans une colonne ou un disque) et est sélectivement attiré à la surface de cette phase solide.

Application: Technique préparatoire (Ex: SPE avant LC-MS/MS)

Question 42

En HPLC, quelles caractéristiques de la colonne dicte la pression requise pour le système?

Answer 42

La pression requise du système dépend des caractéristiques de la colonne :

• taille des particules
• longueur/diamètre interne de la colonne

Pression augmente si taille des particules de la phase stationnaire diminue

Question 43

Quelle est la limite de pression en HPLC et UPLC?

Answer 43

HPLC : 5000-6000 psi

UHPLC : 19 000 psi