Techniques De Biomol 3 Flashcards
Quel est le role de l’ADN polymérase dans la réaction de
PCR?
L’ADN polymérase synthétise le brin complémentaire à partir des amorces, la résultante étant deux nouveaux fragments d’ADN double-brin.
Quelles est l’avantage de la PCR?
Peut amplifier n’importe quelle séquence d’ADN pour avoir assez de matériel pour l’analyser ou la modifier.
Quel est l’inconvénient de la PCR?
On doit connaître la séquence d’ADN à amplifier!
Quels sont les utilités de la PCR en laboratoire ?
• Séquençage de l’ADN
• Génotypage d’organismes modèles
• Clonage moléculaire/mutagenèse dirigée
• Amplification de cDNA (transcription réverse)
• PCR en temps réel (qPCR)
• Marquage de l’ADN (Southern Blot)
• Diagnostic médical
• Identification judiciaire
Quels sont les 5 éléments essentiels à la PCR et quels sont leurs rôles?
1- La polymérase : polymérise et donc amplifie le nouvel ADN à partir d’un ADN matrice
2- Amorces : sont des oligonucléotides simple brin complémentaire à l’ADN à amplifier
3- Les désoxynucléotides triphosphates : sont un mélange de dATP, dTTP, dCTP, dGTP nécessaire à l’amplification de l’ADN
4- Le tampon : contient la concentration appropriés d’ions et le bon pH pour une PCR optimale. Sera diluée dans l’eau
5- La matrice d’ADN : est l’ADN d’intérêt que l’on veut amplifier
Quels sont les 3 étapes d’un cycle PCR?
1- Dénaturation
2- Hybridation
3- Élongation
À partir de quel cycle verra-t-on des fragments amplifiés doubles brin sans ADN simple brin?
3e cycle
Quels sont les étapes du PCR (au complet)?
1- Dénaturation initiale
2- Dénaturation
3- Hybridation
4- Élongation
5- Élongation finale
6- Étapes finale de refroidissement
Quels sont les caractéristiques du fragment Klenow de la pol I de E. Coli?
• Activité polymérase 5’ 3’
• Activité exonucléase 3’ 5’
• Mais… se dénature à haute température
Quels sont les caractéristiques de la Taq polymérase?
• Thermostable à haute température
• Agit à haute température, donc pas de structure secondaires formées sur l’ADN amplifiée
• Inconvénient: ne possède pas d’activité exonucléase 3’5’,
donc ne peut pas corriger ses erreurs!
• Inconvénient: inhibée par plusieurs molécules: EDTA, DMSO, urée, phénol, ethanol, etc.
• Ajoute un A à la fin du fragment généré, utile pour le clonage TA
Quels sont les caractéristiques de la polymérase Pfu et la Deep Vent?
- Thermophile, donc très stables à haute température
- on un domaine exonucléase, pour assurer une relecture
Quelles sont les caractéristiques de la polymérase Phusion?
• 10X plus rapide que la Pfu traditionnelle, utilisée pour les longues amplifications
• Possède un domaine exonucléase 3’5’ pour assurer une relecture
Quels son les caractéristiques de la polymérase Pfx?
Possède un domaine exonucléase, pour assurer une relecture
Quelle est le role des polymérase de type hot start?
Pour réduire la présence de dimères d’amorce ou d’amplification non-spécifique, certaines enzymes sont
conjuguées à des inhibiteurs ou des anticorps qui relâcheront la polymérase à haute température et qui empêcheront l’amplification non-spécifique à basse température
Quels sont les qualités d’une bonne ADN polymérase?
- Processivité
- Fidélité
- Spécificité
- Thermostabilité
Quels est le role d’un tampon?
Optimisé pour avoir le pH adéquat (8-9) et réduire les interactions non-spécifiques ADN-ADN ou ADN- amorce, ADN-polymérase.
De quoi se compose un bon tampon?
- Ions Mg2+
- Ions K+
- DMSO
- Glycérol
Qu’arrive-il avec les phosphates lors de l’ajout d’un dNTP?
- Un phosphate est catalysé par l’ADN polymérase pour la formation du pont phosphodiester
- Un phyrophosphate inorganique PPi est libéré
Quels types d’ADN peut-on utiliser pour la PCR?
- ADN génomique
- ADN plasmidique
- ADN complémentaire
Qu’est-ce que des amorces?
Ce sont des oligonucléotides complémentaires au brin à amplifier
Qu’est-ce que la température de fusion en PCR?
Température à laquelle la moitié de l’ADN est double brin et la moitié est simple brin. Indique la stabilité du duplex d’ADN
Comment une séquence en GC riche influence la température de fusion?
Plus GC est riche, plus la température de fusion sera élevée
Quels sont les facteurs qui influencent la température d’hybridation?
• La concentration des amorces qui sera
utilisée
• La concentration des sels dans le tampon
• L’utilisation de DMSO dans le tampon pour
les séquences riches en GC peut diminuer le Tm de 0.5 degré Celsius /%DMSO
Qu’est-ce qu’on veut éviter quand on design une amorce?
• Structure secondaire de type tête d’épingle (hairpin)
• Complémentarité entre les amorces (dimères)
• Répétitions
• Plus de trois C ou G à la fin de la séquence
Qu’est-ce qu’une mutagénèse dirigée?
La mutagenèse dirigée permet de spécifiquement muter l’ADN d’un plasmide par PCR (la séquence codante d’un gène), et ainsi la protéine produite se retrouve mutée
À quoi sert la mutagénèse dirigée?
- Comprendre la fonction d’une protéine
- Comprendre la fonction d’un acide aminé en particulier au sein d’une protéine
- Ingénierie des protéines mutantes plus performantes
Que permet la transcription réverse?
Quantifier l’expression relative (la quantité d’ARNm) d’un gène par rapport à un autre (voir qPCR), en quantifiant la quantité l’ARNm transcrit de ce gène.
Quelles sont les deux étapes de la RT-PCR?
1) Lafabricationd’unADNcomplémentaire (ADNc) par transcription réverse (RT pour reverse transcription) à partir d’une matrice d’ARNm à l’aide de la transcriptase réverse
2) L’amplification de l’ADNc avec une PCR
Quelles sont les 3 activités spécifiques des transcriptases réverse?
- ADN polymérase ARN-dépendante
- Endonucléase
- ADN polymérase ADN-dépendante
Quelles sont les 2 types d’amorce en transcription réverse?
- Amorces oligo dT: Amplifie la queue poly À de l’ARNm (pas spécifique)
- Amorces hexamères : Amplifie non-spécifiquement tous les ARN
Quelles sont les étapes de la transcription réverse?
- Une amorce oligo dT s’hybride à la queue poly(A) de l’ARNm.
- La transcriptase réverse se lie à l’amorce oligo dT et initie la synthèse du cDNA complémentaire en ajoutant des dNTPs.
- L’hybride ARN/ADN est maintenant complet.
- L’ARNm est dégradé par l’activité endonucléase de la réverse transcriptase, il ne reste que l’ADNc.
- L’ADNc peut maintenant être amplifié par PCR, en utilisant des amorces spécifiques au fragment cible voulant être amplifié.
Quel type de réaction est la réaction PCR?
Exponentielle
Qu’est-ce que Ct sur la courbe de PCR?
Le nombre de cycles ou le produit d’amplification d’ADN par qPCR peut être détecté au-dessus du signal de bruit-de-fond. (La ou on commence la phase exponentielle)
Qu’est-ce que SYBR Green?
• La sonde fluorescente SYBR Green se lie sur l’ADN double brin, donc après l’élongation.
• Lors de chaque cycle de PCR, il devient alors possible de quantifier son émission à 520 nm et de déterminer la quantité d’ADN amplifié en temps réel.
Qu’est-ce que la sonde de type 5’nucléase?
- Une amorce avec un fluorophore en 5’ et une molécule « extinctrice » (quencher) en 3’.
- La fluorescence du fluorophore est « éteinte » par la molécule extinctrice.
- La sonde fluorescente est libérée par l’activité 5’->3’ exonucléase de la polymérase et peut émettre de la fluorescence
Que signifie un petit Ct?
Que l’ARNm du gène d’intérêt est abondant
Qu’elles sont les caractéristiques médiée par l’amplification isotherme?
- Isotherme
- L’ADN polymérase est capable de déplacer le brin
Quelles sont les applications pour l’amplification isotherme?
• Détection de l’ARN du SARS-CoV-2 dans un échantillon
• Détection du virus Zika dans un échantillon
• Détermination de la présence de contaminant dans l’eau et la nourriture
