Techniques De Biomol 3

Question 1

Quel est le role de l’ADN polymérase dans la réaction de
PCR?

Answer 1

L’ADN polymérase synthétise le brin complémentaire à partir des amorces, la résultante étant deux nouveaux fragments d’ADN double-brin.

Question 2

Quelles est l’avantage de la PCR?

Answer 2

Peut amplifier n’importe quelle séquence d’ADN pour avoir assez de matériel pour l’analyser ou la modifier.

Question 3

Quel est l’inconvénient de la PCR?

Answer 3

On doit connaître la séquence d’ADN à amplifier!

Question 4

Quels sont les utilités de la PCR en laboratoire ?

Answer 4

• Séquençage de l’ADN
• Génotypage d’organismes modèles
• Clonage moléculaire/mutagenèse dirigée
• Amplification de cDNA (transcription réverse)
• PCR en temps réel (qPCR)
• Marquage de l’ADN (Southern Blot)
• Diagnostic médical
• Identification judiciaire

Question 5

Quels sont les 5 éléments essentiels à la PCR et quels sont leurs rôles?

Answer 5

1- La polymérase : polymérise et donc amplifie le nouvel ADN à partir d’un ADN matrice
2- Amorces : sont des oligonucléotides simple brin complémentaire à l’ADN à amplifier
3- Les désoxynucléotides triphosphates : sont un mélange de dATP, dTTP, dCTP, dGTP nécessaire à l’amplification de l’ADN
4- Le tampon : contient la concentration appropriés d’ions et le bon pH pour une PCR optimale. Sera diluée dans l’eau
5- La matrice d’ADN : est l’ADN d’intérêt que l’on veut amplifier

Question 6

Quels sont les 3 étapes d’un cycle PCR?

Answer 6

1- Dénaturation
2- Hybridation
3- Élongation

Question 7

À partir de quel cycle verra-t-on des fragments amplifiés doubles brin sans ADN simple brin?

Answer 7

3e cycle

Question 8

Quels sont les étapes du PCR (au complet)?

Answer 8

1- Dénaturation initiale
2- Dénaturation
3- Hybridation
4- Élongation
5- Élongation finale
6- Étapes finale de refroidissement

Question 9

Quels sont les caractéristiques du fragment Klenow de la pol I de E. Coli?

Answer 9

• Activité polymérase 5’  3’
• Activité exonucléase 3’  5’
• Mais… se dénature à haute température

Question 10

Quels sont les caractéristiques de la Taq polymérase?

Answer 10

• Thermostable à haute température
• Agit à haute température, donc pas de structure secondaires formées sur l’ADN amplifiée
• Inconvénient: ne possède pas d’activité exonucléase 3’5’,
donc ne peut pas corriger ses erreurs!
• Inconvénient: inhibée par plusieurs molécules: EDTA, DMSO, urée, phénol, ethanol, etc.
• Ajoute un A à la fin du fragment généré, utile pour le clonage TA

Question 11

Quels sont les caractéristiques de la polymérase Pfu et la Deep Vent?

Answer 11

• Thermophile, donc très stables à haute température
• on un domaine exonucléase, pour assurer une relecture

Question 12

Quelles sont les caractéristiques de la polymérase Phusion?

Answer 12

• 10X plus rapide que la Pfu traditionnelle, utilisée pour les longues amplifications
• Possède un domaine exonucléase 3’5’ pour assurer une relecture

Question 13

Quels son les caractéristiques de la polymérase Pfx?

Answer 13

Possède un domaine exonucléase, pour assurer une relecture

Question 14

Quelle est le role des polymérase de type hot start?

Answer 14

Pour réduire la présence de dimères d’amorce ou d’amplification non-spécifique, certaines enzymes sont
conjuguées à des inhibiteurs ou des anticorps qui relâcheront la polymérase à haute température et qui empêcheront l’amplification non-spécifique à basse température

Question 15

Quels sont les qualités d’une bonne ADN polymérase?

Answer 15

• Processivité
• Fidélité
• Spécificité
• Thermostabilité

Question 16

Quels est le role d’un tampon?

Answer 16

Optimisé pour avoir le pH adéquat (8-9) et réduire les interactions non-spécifiques ADN-ADN ou ADN- amorce, ADN-polymérase.

Question 17

De quoi se compose un bon tampon?

Answer 17

• Ions Mg2+
• Ions K+
• DMSO
• Glycérol

Question 18

Qu’arrive-il avec les phosphates lors de l’ajout d’un dNTP?

Answer 18

• Un phosphate est catalysé par l’ADN polymérase pour la formation du pont phosphodiester
• Un phyrophosphate inorganique PPi est libéré

Question 19

Quels types d’ADN peut-on utiliser pour la PCR?

Answer 19

• ADN génomique
• ADN plasmidique
• ADN complémentaire

Question 20

Qu’est-ce que des amorces?

Answer 20

Ce sont des oligonucléotides complémentaires au brin à amplifier

Question 21

Qu’est-ce que la température de fusion en PCR?

Answer 21

Température à laquelle la moitié de l’ADN est double brin et la moitié est simple brin. Indique la stabilité du duplex d’ADN

Question 22

Comment une séquence en GC riche influence la température de fusion?

Answer 22

Plus GC est riche, plus la température de fusion sera élevée

Question 23

Quels sont les facteurs qui influencent la température d’hybridation?

Answer 23

• La concentration des amorces qui sera
utilisée
• La concentration des sels dans le tampon
• L’utilisation de DMSO dans le tampon pour
les séquences riches en GC peut diminuer le Tm de 0.5 degré Celsius /%DMSO

Question 24

Qu’est-ce qu’on veut éviter quand on design une amorce?

Answer 24

• Structure secondaire de type tête d’épingle (hairpin)
• Complémentarité entre les amorces (dimères)
• Répétitions
• Plus de trois C ou G à la fin de la séquence

Question 25

Qu’est-ce qu’une mutagénèse dirigée?

Answer 25

La mutagenèse dirigée permet de spécifiquement muter l’ADN d’un plasmide par PCR (la séquence codante d’un gène), et ainsi la protéine produite se retrouve mutée

Question 26

À quoi sert la mutagénèse dirigée?

Answer 26

• Comprendre la fonction d’une protéine
• Comprendre la fonction d’un acide aminé en particulier au sein d’une protéine
• Ingénierie des protéines mutantes plus performantes

Question 27

Que permet la transcription réverse?

Answer 27

Quantifier l’expression relative (la quantité d’ARNm) d’un gène par rapport à un autre (voir qPCR), en quantifiant la quantité l’ARNm transcrit de ce gène.

Question 28

Quelles sont les deux étapes de la RT-PCR?

Answer 28

1) Lafabricationd’unADNcomplémentaire (ADNc) par transcription réverse (RT pour reverse transcription) à partir d’une matrice d’ARNm à l’aide de la transcriptase réverse
2) L’amplification de l’ADNc avec une PCR

Question 29

Quelles sont les 3 activités spécifiques des transcriptases réverse?

Answer 29

• ADN polymérase ARN-dépendante
• Endonucléase
• ADN polymérase ADN-dépendante

Question 30

Quelles sont les 2 types d’amorce en transcription réverse?

Answer 30

• Amorces oligo dT: Amplifie la queue poly À de l’ARNm (pas spécifique)
• Amorces hexamères : Amplifie non-spécifiquement tous les ARN

Question 31

Quelles sont les étapes de la transcription réverse?

Answer 31

1. Une amorce oligo dT s’hybride à la queue poly(A) de l’ARNm.
2. La transcriptase réverse se lie à l’amorce oligo dT et initie la synthèse du cDNA complémentaire en ajoutant des dNTPs.
3. L’hybride ARN/ADN est maintenant complet.
4. L’ARNm est dégradé par l’activité endonucléase de la réverse transcriptase, il ne reste que l’ADNc.
5. L’ADNc peut maintenant être amplifié par PCR, en utilisant des amorces spécifiques au fragment cible voulant être amplifié.

Question 32

Quel type de réaction est la réaction PCR?

Answer 32

Exponentielle

Question 33

Qu’est-ce que Ct sur la courbe de PCR?

Answer 33

Le nombre de cycles ou le produit d’amplification d’ADN par qPCR peut être détecté au-dessus du signal de bruit-de-fond. (La ou on commence la phase exponentielle)

Question 34

Qu’est-ce que SYBR Green?

Answer 34

• La sonde fluorescente SYBR Green se lie sur l’ADN double brin, donc après l’élongation.
• Lors de chaque cycle de PCR, il devient alors possible de quantifier son émission à 520 nm et de déterminer la quantité d’ADN amplifié en temps réel.

Question 35

Qu’est-ce que la sonde de type 5’nucléase?

Answer 35

• Une amorce avec un fluorophore en 5’ et une molécule « extinctrice » (quencher) en 3’.
• La fluorescence du fluorophore est « éteinte » par la molécule extinctrice.
• La sonde fluorescente est libérée par l’activité 5’->3’ exonucléase de la polymérase et peut émettre de la fluorescence

Question 36

Que signifie un petit Ct?

Answer 36

Que l’ARNm du gène d’intérêt est abondant

Question 37

Qu’elles sont les caractéristiques médiée par l’amplification isotherme?

Answer 37

• Isotherme
• L’ADN polymérase est capable de déplacer le brin

Question 38

Quelles sont les applications pour l’amplification isotherme?

Answer 38

• Détection de l’ARN du SARS-CoV-2 dans un échantillon
• Détection du virus Zika dans un échantillon
• Détermination de la présence de contaminant dans l’eau et la nourriture