Technique De Biomol 4 Et 5 Flashcards
L’expression des gènes donne lieu à quoi?
- La différenciation cellulaire
- Le développement
- La complexité phénotypique des espèces vivantes
L’expression des gènes est affecté par quoi?
- Le profil épigénétique dans la cellule en question
- Le métabolisme cellulaire
- Les mutations
L’étude du profils d’expression génétique permet quoi?
- Comprendre les phénomènes physiologiques et physiopathologiques
- De mettre en valeur de fonctions spécifiques à un tissus, une condition
- la médecine personnalisée
L’ensemble de la distribution de l’expression des gènes constitue quoi?
Son profil d’expression
Qu’est-ce qu’un profil d’expression génique?
Le profile d’expression des gènes est une image captée de manière instantannée, au niveau moléculaire. Il représente la distribution de l’expression d’un ensemble de genes pour une ou plusieurs conditions.
Qu’est-ce qu’un échantillon de référence?
Un échantillon de référence est utilisé pour obtenir une mesure des niveaux “normaux” d’ARN dans un état que l’on définit comme étant “normal” (le contrôle)
Quels sont les éléments essentiels pour définir un profil d’expression génique?
- Un échantillon de référence
- Des gènes de référence interne
Que permettent les gènes de références internes?
Permet de determiner les niveaux d’expression des gènes qui ne devraient pas varier dans les différents échantillons. Ces niveaux d’expression serviront de niveaux de base afin d’effectuer une normalisation des valeurs dans les échantillons expérimentaux pour comparaison
Qu’est-ce que le Nothern Blots?
Permet de determiner la taille de l’ARN et des variants d’épissage alternatifs d’un gène
Quels sont les étapes du Nothern Blot?
1- Isolation de l’ARN totale ou Poly(A)n-positive
2- Migration sur un gel dénaturant d’agarose (avec formaldehyde pour séparer les tailles d’ARN)
3- Transfert sur membrane (nylon, sous vide)
4- Cible d’ARN est détectée par hybridation avec sonde radiomarquée (a-P32) complémentaire
5- L’ARN ayant hybridé avec la sonde radiomarquée sur la membrane est détectée par autoradiographie. L’intensité du signal resultant est proportionnel à la quantité d’ARN présent dans l’échantillon
Comment interprète-t-on le signal dans la technique du Nothern Blot?
Comparaison des signaux provenant de deux ou plusieurs populations de cellules ou tissus en :
- Observant les différences dans les niveaux d’expression des gènes
- Mesure de l’abondance des ARNm
- Mesure de la taille des ARNm
Quel est le but de la normalisation des données?
Le but de la normalization est d’éliminer toute difference apparente causée par le transfert inégal des ARN sur la membrane ou les quantités inégales d’ARN chargées sur le gel
Quels sont les avantages de la technique Nothern Blots?
- Protocols bien établis
- Sensible sur une large plage de tailles
- Largement utilisée
Quels sont les inconvénients de la technique Nothern Blots?
- Radioactif
- Moins précis que technique plus moderne
- Alternative non radioactive
- Se limite à la détection d’ARN précis connu
- Ne permet pas la découverte de nouveaux gènes différenciellement exprimés entre les échantillons
Que permet la technique essai de protection à une nucléase?
Permet de révéler la presence d’ARN de sequences connues (même si presents en faibles quantités) dans un échantillon hétérogène d’ARN extrait des cellules
Quels sont les étapes de la méthode d’essai de protection à une nucléase?
1- L’ARNm est dabord extrait des cellules
2- L’ARNm est mélangé avec un ARN anti- sense ou des sondes d’ADN complémentaires à la sequence d’intérêt.
3- Les brins complémentaires s’hybrident pour former l’ARN double-brin ou un hybride ARN- ADN.
4- L’ajout de la ribonuclease (Rnase) S1 ou RNAse A clive spécifiquement les simples brins d’ARN et laisse intact les ARN double brin formés entre l’ARNm d’intérêt et la sonde
5- Les ARN non-hybridés (donc non protégés) sont degradés en petits oligomères puis en nucleotides individuels
6- Les fragments d’ARN intacts sont ceux qui sont complémentaires à la sonde, donc représentent les ARNm d’intérêt
7- Les fragments sont précipités (phenol- chloroforme) et migrés par gel d’agarose
8- La quantité de sonde est proportionnelle à la quantité d’ARNm cible dans la population d’ARN totale
Quelles sont les avantages de la technique d’essai de protection à une nucléase?
- Peut distinguer et quantifier des ARN ayant de fortes homologies de séquence
- Méthode rapide pour quantification directe
- Permet l’analyse d’ARN peu abondants: pouvoir suppérieur de détection
Quels sont les inconvénients de la technique d’essai de protection à une nucléase?
- Utilise des sondes radioactives (voir alternatives de remplacement)
- Méthode ciblée qui se limite à la detection d’ARN précis connus (non haut-debit)
- Ne permet pas la découverte de nouveaux gènes différentiellement exprimés entre les échantillons
Qu’est-ce que la technique SAGE?
Permet de générer des fragments de transcrits d’ARNm disposés en série pour un échantillon donné
Quelles sont les étapes de la méthode SAGE?
1- Isolation de l’ARN
2- Synthèse de l’ADNc via des amorces oligodT-supportées par des billes magnétiques porteurse de biotine
3- Digestion de l’ADNc avec l’enzyme de restriction NiaIIII pour générer des extrémités 3’-cohésives
4- Ligation des extrémités 3’-digérées avec des adaptateurs ou linkers
5- BsmF1 coupe à 10 pB du site NiaIII, soit le site indiqué par TE, ce qui génère des fragments de 10-14 pb, appelées TAG, avec des extrémités d’ADNc dits blunts ou franches
6- Ligation des TAG, appelées aussi DiTAG
7- Digestion des TAG avec NiaIII
8- Ligation et formation de concaténers grace au portions GTAC extrémités cohésive
Quels sont les avantages de la méthode SAGE?
- Méthode très sensible pour de petites quantités d’ARN (amplification)
- Évite l’utilisation de sondes radioactives
- Se rapproche d’une technique à haut debit (non-ciblée)
Quels sont les inconvénients de la méthode SAGE?
- La petite taille des tag peut rendre difficile l’assignation des séquences (1/N4) (complexité des tag)
-Méthode requérant plusieurs étapes - Méthode requérant une grande précision de séquençage
