Techniques De Biomol 1 Flashcards
Quelles sont les différentes types de lyse cellulaire?
Chimique : détergents, la plus utilisé
Enzymatique : protéinases K, collagénase et lysozyme
Mécanique : billes de broyage
Quelles sont les 4 étapes de la purification des acides nucléiques?
1) lyse des cellules
2) dénaturation des protéines et des complexes nucléoprotéiques
3) inactivation des nucléases
4) Purification des acides nucléiques
Quels sont les différents agents utilisé pour la dénaturation des protéines?
- Détergents ioniques
- Agents réducteurs
- Agents chaotropes
Quelles sont les caractéristiques de la protéine kinase K?
Protéase végétale très active, même en présence de SDS ou d’EDTA, et qui n’a aucun effet d’hydrolyse sur les acides nucléiques.
Quelles sont les caractéristiques du SDS?
SDS est un détergent organique capable de dénaturer les protéines en supprimant les liaisons non-covalentes. C’est aussi un tensioactif amphiphile. Lors de la dénaturation, les anions du SDS confère aux protéines une charge globale -
Qu’est-ce que l’EDTA?
L’EDTA est un agent chelateur puissant qui forme des complexes métalliques très stables. En séquestrant les ions magnésium Mg2+, il bloque l’activité de nombreuses
nucléases.
Quelles sont les précautions à prendre lors de l’isolation des ARNs?
1) inhiber les RNases endogènes en utilisant une solution de lyse contenant un inhibiteur de RNases
2) Solution de lyse : pH non basique, car aRNs sensibles au ions OH-
3) Éviter l’apport de RNases exogènes -> mains gantées et milieux et matériels autoclavés
4) travailler à 4 degré celcius
Lorsqu’on purifie l’ADN, qu’est-ce qui se retrouve dans quelle phase?
- L’ADN est soluble dans l’eau
- Les protéines sont solubles dans le phénols
Quel est le principe de précipitation de l’ADN avec l’éthanol ou le sodium?
La solubilisation de l’ADN est fonction de la polarité du
solvent. L’eau est très polaire, donc un excellent solvent
pour l’ADN.
Lorsqu’on ajoute l’éthanol et le sodium, les forces
d’attraction entre les groupes phosphates de l’ADN (PO-) et
le Na+ deviennent plus fortes, ce qui précipite l’ADN.
Quel est le principe de la purification de l’ADN sur la membrane de silice?
En présence de sels chaotropiques, l’ADN se lie au silice, dû à la déshydration et la formation de ponts hydrogènes
Comment pouvons nous faire une estimation quantitative de la concentration des acides nucléiques par spectroscopie?
Les bases azotés de l’ADN et des ARNs absorbent l’énergie lumineuse dans la région ultraviolette. Elles absorbent de manière maximale à 260 nm
Comment la présence de protéine affecte-elle la spectroscopie des acides nucléiques?
Augmente l’absorbante à 280 nm
Que suggère une Absorbance à 230nm dans la spectroscopie des acides nucléiques?
Suggère la présence de phénol ou d’urée
Que suggère une Absorbance à 325 nm dans la spectroscopie des acides nucléiques?
Suggère la présence de particules/poussières
Comment pouvons-nous quantifier l’ADN par Hoechst 33258?
Agent intercalant, spectrofluoromètre capable d’excitation à 365 nm et d’émission à 460 nm. Méthode basée sur une courbe d’étalonnage
Comment pouvons-nous quantifier l’ADN par PicoGreen?
Aussi basé sur une courbe d’étalonnage à l’aide d’une solution stock d’ADN, mesure de la fluorescences à l’aide d’un spectrofluoromètre, excitation a 480 nm et émission à 520 nm
Dans quelles conditions les méthodes de quantification de l’ADN démontrent-elles de belles linéarités?
Absorbance à 260 nm = à de plus grande concentration
Hoechst 33258 = à de faible concentration
PicoGreen = à de très faible concentration
Que permet la technique d’électrophorèse sur gel d’agarose?
Technique qui permet de séparer, identifier et purifier les fragment d’ADN
Quelles sont les 3 étapes de l’électrophorèse sur gel d’Agarose?
(1) Préparation du gel d’agarose selon la taille des fragments à séparer
(2) Application du champ électrique à voltage constant
(3) Visualization/purification de l’ADN
Est-ce qu’on voit l’ADN dans l’électrophorèse sur gel d’Agarose?
Non, on doit ajouter un agent intercalant et être analyser sous lampe UV
Quels sont les paramètres affectant la migration dans le gel d’Agarose?
1- Le sens du courant : les acide nucléiques étant chargés -, ils migrent vers la bornes +
2- Le voltage : plus la différence de potentiel est grande, plus la migration sera rapide. Mais si trop élevée , peut faire fondre le gel
3- La taille des molécules : a cause de la structure poreuse de la matrice d’agarose, elle peut retarder la migration des acides nucléiques. Plus une molécule est grosse plus elle sera retardé
4- Le % d’agarose : un gel concentré en agarose augmentera la séparation entre les grosses et petites molécules
Comment préparer une solution pour une transfectiion de cellules eucaryotes?
- Mélanger l’ADN + agent cationique lipidique (sans sérum)
- Formation de complexes (incuber 15 min à temp ambiante)
- Ajouter le milieu de transfection
- Rinser les cellules avec le milieu de transfection
- Incuber 2-24h et changer le milieu
Comment se produit une transfection par calcium phosphate ?
Basée sur la formation d’un précipité lorsqu’on mélange lentement une solution phosphate tamporisée et une solution de chlorure de calcium (CaCl2) contenant l’ADN.
Le précipité adhère ensuite aux cellules et pénètre par endocytose.
Comment se produit une transfection par électroporation?
Basée sur le fait que des pulsations électriques (millisecondes) générent des trous dans la membrane cellulaire, permetant ainsi à l’ADN de pénétrer la cellule
Qu’est-ce que l’hybridation?
Appariement, par complémentarité des bases, de deux
séquences nucléotidiques, en antiparallèle.
De quel nature le marqueur peut-il être dans l’hybridation des acides nucléiques?
- Isotope radioactif : sonde radioactive
- Non radioactif : sonde froide
Comment se produit un marquage radioactif?
On utilise un isotope radioactif d’un atome qui est souvent le 32Phosphore. Rayonnement émis = impression sur le film photographique = détection de la radioactivité
Quels sont les différents marqueurs à froid qu’on peut utilisé?
Biotine ou DIG
Qu’est-ce que le blotting?
• Technique permettant l’étude de fragment cibles (ADN ou ARN) par hybridation d’une sonde nucléique (ADN ou ARN)
• Technique reposant sur la notion de spécificité d’appariements des bases
• Nécessite de dénaturer les acides nucléiques afin d‘obtenir un ADN simple brin et/ou éliminer les structures secondaires des ARN
Qu’est-ce que la dénaturation/renaturation?
• Phénomène réversible pour accéder à l’information génétique lors de la réplication et de la transcription;
• Nécessite la rupture des liaisons hydrogènes entre les bases
Quelles sont les étapes de la méthode southern blot?
- L’ADN est digéré par les enzymes de restriction
- Séparation des fragments digérés par électrophorèse sur gel d’agarose
- Le gel d’électrophorèse est trempé dans une solution alcaline (contenant habituellement de l’hydroxyde de sodium) afin de permettre la dénaturation de l’ADN (séparation de l’ADN double-brin en simple-brin).
- Une feuille de membrane en nitrocellulose ou en nylon est placée sur le gel. Une pression est appliquée au gel par un poids.
- Déplacement de l’ADN contenu dans le gel sur la membrane par capillarité grâce à une solution saline et à l’utilisation de papier absorbant. L’ADN va se fixer sur la
membrane. - La membrane est ensuite chauffée (dans le cas de nitrocellulose) ou exposée au rayonnement ultraviolet (nylon) afin de fixer de manière permanente l’ADN sur la
membrane. - La membrane est ensuite mise en contact avec une sonde spécifique de la séquence d’ADN recherchée. La sonde est marquée de sorte qu’elle puisse être détectée, par incorporation de radioisotopes ou par “étiquetage” de la molécule avec un fluorophore ou un antigène tel que la digoxygénine (DIG).
- Après hybridation, la sonde en excès est éliminée de la membrane par différents lavages, et l’hybridation est visualisée sur un film autoradiographique, dans le cas
d’une sonde radioactive ou fluorescente.
Quels sont les agent retrouvés pour l’extraction de lyse des protéines?
- Inhibiteurs de protéases
- Agent Chelateur
- Inhibiteurs de phosphatases
Comment se produit une purification par chromatographie sur colonne?
Il s’agit ici d’une séparation des protéines selon leur taille utilisant un tamis moléculaire
Quelles sont les méthodes de quantification des protéines?
- Par spectrophotométrie : déterminer l’absorbante à 280 nm
- Par méthode Bradford : Basée sur le fait que l’absorbance max d’une solution de bleu de Coomassie passe de 465 nm à 595 nm lorsqu’en présence de protéines (intéractions hydrophobes et ioniques)
Quelle est le principe de base du western blot?
L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) à une dimension en conditions dénaturantes (avec SDS) permet la
séparation des protéines sur la base de leurs poids moléculaires. L’électrophorèse s’effectue de façon verticale. Les protéines couplées au SDS ont une charge négative et migrent donc de la cathode négative vers l’anode positive
Comment peut-on détecter les protéines par Western Blot?
- Détection de la chemiluninesce : exposition sur film X-ray et détection par caméra CCD
- Détection par infrarouge : détection par LI-COR Odyssey
