Techniques De Biomol 2 Flashcards
Quel est le principe de détection par cytométrie en flux (FACS)?
Analyse multiparamétrique par fluorescence des propriétés physiques et chimiques de plusieurs milliers de particules par secondes
Quels sont les objectifs de FACS?
- Permet l’analyse de constituants cellulaire
- Permet l’analyses d’organites isolés
- Certains instruments permettent aussi l’isolation de populations de cellules précises
L’analyses par FACS renseigne sur quoi?
Les phénotypes cellulaire et les fonctions cellulaires
Quelles sont les 3 parties du cytomètre en flux?
1) un réseau fluidique constitué d’une veine liquide s’écoulant à vitesse constante
2) Un banc optique avec une ou plusieurs sources lumineuses monochromatiques et ses détecteurs qui permettent de quantifier les diverses fluorescences émises par chaque particules
3) un microprocesseur qui convertir les signaux électriques en signaux numériques
Quelles est la différence entre FSC et SSC?
- FSC : lumière réfractée en direction continue au rayon lumineux. Renseigne sur la taille de la particule et permet l’exclusion des doublets de cellules
- SSC : lumière réfractée dans une direction différente (mesurée a 90 degré Celsius) du rayon lumineux. Renseigne sur la granularité/complexité de la particule
Qu’est-ce qu’un fluorochrome?
Une molécule qui peut absorber l’énergie depuis une source lumineuse
Qu’est-ce que la fluorescence?
Lorsqu’une molécule émet des photons de moindre énergie
Quels sont des exemple d’application d’analyses par FACS?
- Immuno-phénotypage
- Détection d’un gène rapporteur
- Détection de la division cellulaire
- Analyses de prolifération
- Détection de la mort cellulaire par apoptose
- Indicateur du métabolisme cellulaire
- Triage cellulaire
Quel est le principe de ELISA?
Analyses quantitative de la présence d’un antigène d’intérêt dans un échantillon biologique donné à l’aide d’anticorps et d’une réaction enzymatique colorimétrique
Quels sont les différents types d’ELISA?
Direct, indirecte, sandwich et compétitif
Que permet ELISA indirect?
Permet la quantification de titres d’anticorps sériques
Que permet ELISA sandwich?
Permet la quantification d’une protéine d’intérêt
Quelles sont les étapes d’ELISA?
1- Un anticorps de capture est absorbé par le pétri
2- Les sites non-occupés sont bloqués à l’aide de protéines
3- LEs échantillons sont incubés
4- Un anticorps biotinylé est ajouté
5- Un complexe enzyme HRP-Adivine est ajouté, suivit du substrat
Quel est le principe d’ELISPOT?
Même principe qu’ELISA de type sandwich, mais des cellules sécrétant l’Antigènes d’intérêt sont utilisés comme échantillons biologiques
Quel est le principe d’ELISPOT
Même principe qu’ELISA de type sandwich, mais des cellules sécrétant l’Antigènes d’intérêt sont utilisés comme échantillons biologiques
Que permet ELISPOT?
Permet de mesurer une quantité de cellules qui répondent à un stimulus donné en sécrétant une protéine d’intérêt
Quelles sont les étapes d’ELISPOT?
1- Un anticorps de capture est absorbé par le pétri
2- Les sites non-occupés sont bloqués à l’aide de protéines
3- Des cellules sont ajoutés + stimuli
4- Les cellules sont lavées
5- Un anticorps biotinylé est ajouté
6- Un complexe enzyme HRP-Avidine est ajouté
7- Le substrat de l’enzyme est ajouté
Quel est le principe de la co-immunoprécipiration de protéines?
Vise à isoler des complexes composés de 2 ou plus protéines.
Que permet la co-immunoprécipitation des protéines?
Permet l’étude d’interaction entre plusieurs protéines
Quelles sont les étapes de la co-immunoprécipitation de protéines?
1- Extraction des protéines
2- Ajout d’un anticorps monoclonal
3- Ajout de la sépharose (capable de lier l’anticorps)
4- Précipitation
5- Laver
6- Détection de la protéine 2 par Western Blot
Quel est le principe de la microscopie en fluorescence?
Combiné les propriétés de magnification de la microscopie aux propriétés fluorescentes des fluorochromes
Que permet la microscopie en fluorescence?
Permet d’identifier avec précision et en détail des cellules et ses composantes microscopiques
Que permet l’utilisation du microscope confocal?
Réalisé des images à de très faibles profondeur de champ, ce qui permet d’obtenir une représentation 3D de l’obet
Quelles sont les diverses techniques de microscopie de fluorescence?
- Immunomarquage à l’aide d’un anticorps couplé à un fluorochrome
- Transfection de protéines fusionnées à une protéines fluorescentes, typiquement la GFP
- Analyse par FRAP, qui permet d’étudier la diffusion d’une molécule
- Analyse par FRET, qui permet d’étudier l’interaction entre 2 molécules
Quel est le principe de FRAP?
La protéine d’intérêt couplée à un fluorochrome est introduite dans une cellule. Une zone particulière est ensuite éteinte par photoblanchiment, et l’on mesure la restauration de la fluorescence. L’équation permet d’estimer la constante de diffusion de la protéine
Quel est le principe de la spectroscopie de masse?
Analyses qualitative et quantitative de milliers de molécule comprises dans un échantillon donné.
Que permet la SM?
Permet donc d’identifier des molécules dans un échantillon et de mesurer l’abondance de ces molécules
Sur quoi repose la SM (2 choses)?
- Le principe d’ionisation des molécules
- La mesure du ratio masse/charge des ions produits
La SM est souvent procédé par quoi?
Une étape de séparation des molécules par chromatographie
Sur quoi se base la chromatographie?
Le principe de l’affinité des différentes molécules avec des solvants
Quel est le principe de SITA?
Analyse LC-MS qui permet de suivre le flux de réaction biochimiques auxquelles un substrat métabolique d’intérêt est soumis
Quel est le principe de l’analyse de flux extracellulaire?
Analyse du profil bioénergétique en temps réel de cellule adhérentes
Quelles sont les 2 voies métaboliques principales mesurer par l’analyse de flux extracellulaire?
La glycolyse et la respiration mitochondriale
Qu’est-ce que la respiration mitochondriale?
Utilisé le catabolisme du glucose et requiert la consommation d’oxygène
Qu’est-ce que le métabolisme glycolytique?
Caractérisé par le catabolisme du glucose jusqu’en lactate
Qu’est-ce qui est mesurer dans l’analyse de flux extracellulaire?
La teneur en oxygène et l’acidité du milieu simultanément et en temps réel
