Spectrophotométrie Flashcards
La spectrophotométrie c’est quoi
c’est la mesure de l’intensité lumineuse qui est absorbée, émise ou diffusée par un spécimen
À quoi sert la mesure de l’absorbance d’un échantillon ?
À déterminer sa concentration (selon l’intensité de lumière transmise par l’analyte)
Les deux types d’appareils de spectrophotométrie en labo
Spectrophotomètre d’absorption moléculaire :
- Photométrie d’absorption (absorption de lumière par les molécules)
- Photométrie de diffusion par turbidimétrie (diffusion de la lumière)
Dans les deux cas : mesure la lumière transmise
Qu’est-ce que la photométrie d’absorption
- Faisceau lumineux dirigé vers l’échantillon
- La substance absorbe une partie de l’énergie lumineuse
- on mesure l’intensité de la lumière transmise (qui a traversé la substance)
Tous les types de spectrophotométrie
- D’absorption (moléculaire / atomique)
- D’émission (photométrie à flamme/fluorimétrie)
- De diffusion (turbidimétrie/néphélométrie)
Différence entre les deux types de photométrie d’absorption
Moléculaire : molécules, comme un tou, absorbent la lumière
VS
Atomique : les atomes qui absorbent la lumière (ex. cuivre, zinc, plomb)
Les composantes de spectrophotométrie d’absorption moléculaire
- Source lumineuse
- Système mono-chromateur (fenêtres d’entrée et sortie)
- Cuvette
- Détecteur
- Lecteur
La source lumineuse en spectrophotométrie (2 types)
Lampe à incandescence (visible) :
- énergie électrique passe par fil de tungstène via 2 électrodes, et chauffé à incandescence
- spectre 300-1000 nm
* inconvénient majeur = chaleur !!
Lampe à décharge électrique dans un gaz (UV) :
- gaz halogène (surtout, sinon deutérium ou vapeur mercure
- décharge = ionisation du gaz entre 2 électrodes
- lumière couleur différente selon gaz utilisé!
Système monochromateur en spectrophotométrie, but et types ?
But : sélectionne une λ spécifique à la substance
3 types de systèmes mono-chromateurs :
- Filtre (bande de λ!!)
- Prismes
- Réseau de diffraction
Comment fonctionne le filtre en spectrophotométrie ?
- Il sélectionne une bande de λ!!
- le filtre idéal = % transmission élevé (Tmax) et la plus petite bande passante (qui permet grande sensibilité)
V ou F. Certains spectrophotomètre permet de sélectionner différents filtres
Dans certains spectrophotomètres, il est possible de sélectionner ou de changer les filtres en fonction de la longueur d’onde d’absorption de la molécule étudiée. Si plusieurs longueurs d’onde sont disponibles, l’utilisateur peut choisir celle correspondant au pic d’absorption pour optimiser la précision.
Comment mesurer la bande passante du système monochromateur en spectrophotométrie d’absorption moléculaire ?
La valeur du % de transmission maximale (ex. 35%) est divisé par 2 (ex. 17.5%) et 1/2 %Tmax donne la hauteur en y pour les valeurs en x qui correspondent au nb de longueur d’onde du filtre (ex. x2-x1 = 587-551 = 36 λ)
Quelles inscriptions (3) décrivent un filtre sur un spectro d’abs mol ?
λ max (axe x pour peak y) –
largeur bande passante (x2-x1 de y = 1/2 %Tmax) –
% de transmission max (peak axe y)
Ex. 570 – 36 – 35
Quelle est la longueur d’onde nominale d’un filtre ?
λ nominale : λ en x lorsque y = %Tmax
Les 2 types de filtres de spectro d’absorption moléculaire
Note : les filtres sont 1 des types de système mono-chromateur et les 2 types de filtres sont :
- D’absorption (plaque verre abs λ non désirées, donc filtre de couleur complémentaire à soltion analyte, sooo not precise car bande large et % Tmax)
- D’interférence (plusieurs épaisseurs verre/metal/autre, donc + sélectif, mais interférences entre les ondes, obtient monocouche (good bande et %Tmax) ou multicouche (best bande passante et %Tmax)
Quels sont les prismes dans un système mono-chromateur de spectro d’abs mol ?
Décompose la lumière selon la réfraction différentes des λ (le + réfractés = bleus)
- en verre (visible)
- en quartz (UV)
C’est quoi les réseaux de diffraction dans un système mono-chromateur de spectro d’abs mol ?
C’est quoi : Plaque de verre avec mince couche de métal rainurée
Ça fait quoi : Diffraction de la lumière (arrêtes vives)
Résultat : décompose λ (plus de λ diffractées si plus de rainures!)
Types : par transmission ou par réflexion
Plus précisément, explique-moi le fonctionnement d’un système mono-chromateur de réseaux de diffraction (2 fonctionnements)
Par transmission :
- La lumière passe au travers du réseau
- Chaque “sillon” agit comme une arrête vive
- La lumière transmise est diffractée
Par réflexion :
- La lumière est réfléchie sur le réseau
- Chaque “pointe” entre les sillons agit comme une arrête vive
- La lumière réfléchie est diffractée
Les différents types de cuvette dans un spectro d’abs mol
- Ronde (tubes, lumière inégale!)
- Carré-rectangulaire (trajet optique égal, A = acl
- Par aspiration (fixe, + petit vol, facile-stable)
–> verre (visible), quartz (UV), plastique (cheap, but versatile)
Importance d’entretenir les cuvette à spectro
À éviter :
- trace de doigts
- poussières
- dépôt,
- égratignures
- laver à l’eau cuvette quartz sans frotter, sèche à l’air libre
Donc doivent être “calibrées”
Rôle de détecteurs en spectro d’abs mol
–> Capter la lumière dont on désire mesurer l’intensité et émettre un signal électrique mesurable, d’intensité proportionnelle à la lumière qui l’atteint.
*Transforme la mesure en absorbance ou en transmittance
Types de détecteurs en spectro d’abs mol (je ne parle pas des modeles)
- Cellule photovoltaïque
- Cellule photoémissive (simple / tube photomultiplicateur)
- Cellule photoconductrice
C’est quoi la définition de l’électricité ?
Un déplacement d’électrons
Décris-moi le type de détecteur avec cellule photovoltaïque en spectro d’abs mol
- Film métallique qui libère un é (électrode -)
- Métal semi-conducteur (transfert é)
- Métal déficient en électron qui capte é (électrode +)
Utile si appareil soumis à de fortes intensités lumineuses pour des λ de 400-800 nm
Inconvénient : signal diminue avec le temps
Décris-moi le type de détecteur avec cellule photo-émissive simple en spectro d’abs mol
(simple) :
- photocathode qui émet les é lorsque la lumière est détectée (+ lum détectée = + é libérée)
- anode recoit les é
- Qté d’é proportionnel à qté de lumière
Forte ou faible sensibilité pour le détecteur avec cellule photo-émissive en spectro d’abs mol ?
Élevée pour les λ entre 200-1000 nm
Permet de mesurer aussi λ faible intensité
Décris-moi le type de détecteur avec cellule photo-émissive photomultiplicateur en spectro d’abs mol
(photomultiplicateur) :
même principe que le simple, mais ici les é vont frapper d’autre plaques (dynode) qui vont relâcher les é donc amplification de l’effet jusqu’au connecteur !
Avantage : détecte petite qté de lumière !, c’est le + sensible et donc le + utilisé
Décris-moi le type de détecteur avec Cellule photo-conductrice en spectro d’abs mol
La lumière frappe un semi-conducteur (base en céramique)
Libération d’é
Source de tension va attirer é
Avantage : peut miniaturiser le détecteur
Les modèles de spectro d’abs mol permettent d’utiliser quels spectres ?
- UV
- Visible
- IR
V ou F. dans les détecteurs de spectro d’abs mol, il s’agit de cellules, et les détecteurs peuvent être mono ou bicellulaire
V
Quels sont les composantes décrivant les MODÈLES de spectro d’abs mol ?
- Faisceau unique ou double
- Détecteur est mono ou bicellulaire
Donc 4 option possibles:
- unique mono
- unique bi
- double mono
- double bi
Décris-moi le modèle de spectro d’abs mol à faiseau unique monocellulaire
- Source lumineuse
- Système monochromateur
- Une Cuvette
- Un Détecteur (monocellulaire)
5 Lecteur
*1 cuvette à la fois : calibration et blanc passent au préalable), non-recommandé pour mesures en continu (car tjrs enlever, remettre, enlever…)
Décris-moi le modèle de spectro d’abs mol à faiseau unique bicellulaire
- Source lumineuse
- Système monochromateur (le faisceau est divisé en 2!)
- Une Cuvette
- Deux détecteur, car 2e “cellule détectrice” compense les ∆ d’intensité lumineuse (sans cuvette)
5 Lecteur
*1 cuvette à la fois : calibration et blanc passent au préalable), et faisceau moins intense car divisé en 2
Décris-moi le modèle de spectro d’abs mol à faiseau double monocellulaire
- Source lumineuse
- Système monochromateur
- Miroir succession lumière sur E et B
- Deux Cuvettes (E et B) éclairé successivement
- Un Détecteur compare E vs B (monocellulaire)
6 Lecteur
*Nécessite détecteur temps de rxn court!
Décris-moi le modèle de spectro d’abs mol à faiseau double bicellulaire
- Source lumineuse
- Système monochromateur
- Miroir divise faisceau en 2 éclaire E et B même temps
- Deux cuvettes
- 2 Détecteurs compare E vs B (bicellulaire)
6 Lecteur
*Nécessite détecteur temps de rxn court! et peut avoir différence de sensibilité entre les 2 détecteurs
Voyez-vous un inconvénient à l’utilisation du spectro bicellulaire ?
Lorsqu’il y a deux cellules détectrices, s’il y en a un qui fait défaut, tous les résultats sont affectés !
Quel est le principal avantage d’avoir un modèle de spectro à double faisceau ?
Rapidité, car si le faisceau est divisé en deux pour traverser échantillon et blanc en simultané, on sauve du temps
Conditions à l’utilistaion de spectro d’abs mol en biochimie (par exemple)
Le composé (analyte) doit être déjà coloré, ou produire un composé de couleur mesurable suite à une réaction
Comment fait-on pour choisir la longueur d’onde en spectro d’abs mol ?
On regarde la courbe spectrale du composé selon la fiche fourni par le détaillant qui nous vendent des méthodes de dosages (valeurs de référence)
Loi de Beer-Lambert, principe derrière
Les molécules présentes dans la solution absorbent une partie de la lumière donc l’intensité du rayon I1 transmis est plus faible que I0 incident
L’absorbance est directement proportionnelle à la concentration de la substance à doser (c), + la substance est concentré - la lumière transmet donc + la lumière est absorbée
Calcul de la transmittance (loi de Beer)
T = I1 /I0
(x100 si tu veux un %)
Loi de Beer pour l’absorption de la lumière
A = 2 - Log%T
A = -LogT
A = log1/T
Loi de Lambert
L’absorbance est directement proportionnelle à l’épaisseur du milieu traversé par le faisceau lumineux
I = I0 - e^al (relation entre intensité de la lumière et la distance optique à travers l’analyte)
Loi de Beer-Lambert
Combinaison des deux lois :
A = a * c * l
a = coefficient d’absorption molaire (L/mol*cm)
c = mol/L
l = cm
Relie l’abs à la concentration et la longueur du trajet optique
C’est quoi le coefficient d’abs mol ?
Constante (valeur donnée en exam) pour une substance donnée et pour une longueur d’onde utilisée : c’est l’abs d’un analyte dans une solution de 1 mol/L dans une cuvette de 1 cm d’épaisseur à une longueur d’onde donnée
ex. 9.32x10^3 L/mol*cm à 470 nm (composant Thiourée)
Les limites d’utilisation de la loi de Beer-Lambert
- Éviter lumière parasite
- Constance du faisceau lumineux
- Faisceau I0 monochromatique et λ spécifique (%Tmax)
- Solution éch homogène
- Cuvette propre et calibrées
- Seule la substance cible abs spécifique à cette λ
- [éch] intérieur de la lim de linéarité
À quoi sert la courbe spectrale (2) ?
- Déterminer la λ préférentielle d’un analyte à doser, donc quelle λ il y a un %Tmax
- Identifier des susbstances
V ou F. La couleur de la λ préférentielle d’un analyte correspond souvent à la couleur de la solution et donc la λ va varier selon la concentration
F.
- Habituellement il s’agit de la λ de la couleur complémentaire à l’analyte coloré
- λ préférentielle ne change pas selon la concentration
- À l’inverse, λ minimale = couleur de l’analyte
Pourquoi doit-on travailler à la longueur d’onde d’absorption maximale en spectro ?
Car c’est à cette longueur d’onde que les petites variations de concentrations auront des plus grandes variations d’absorbance, donc une meilleure sensibilité de méthode
V ou F. Il est impossible de mesurer directement l’absorbance d’une solution car celle-ci doit être contenue dans un récipient
V. C’est pourquoi on fait le blanc, qui subit les même traitement que l’éch et contient tout sauf l’analyte à doser
La perte de lumière dans le cuvette d’échantillon sont due à quoi ? Quelle est la solution ?
- réflexion de la lumière sur les parois
- absorption de lumière par les parois
- diffusion lumière par les molécules de solvant
Solution ? Le blanc (annule les effets du milieu sur l’absorbance, pour cibler que l’absorbance de l’analyte)
Comment déterminer su un analyseur possède une lampe à gaz ?
Si la lecture est en visible on a une lampe à incandescence vs si lecture en UV on a une décharge électrique dans un gaz donc forcément une lampe à gaz
Considérant l’abs du Stdc est de 0,325, que faudra-t-il faire pour un échantillon ayant comme absorbance 1,76 ?
Impossible à savoir car pas savoir la concentration de Stdc dans ce contexte donnée (et usually la limite de concentration est aussi donnée)
C’est quoi la différence de définition entre la spectrophotométrie et la photométrie ?
Photométrie : mesure l’intensité lumineuse à une ou plusieurs longueurs d’onde
Spectrophoto : Mesure l’absorption ou transmission de lumière qui traverse un spectre de longueur d’onde
Quels sont les 3 grands types de photométrie ?
- Lumineuse (simplement intensité de lumière perçue par l’oeil)
- Colorimétrique (caratérise couleur/intensité lumière)
- D’absorption (abs lum à 1+ longueur d’onde, déterminant [analyte])
Quelle valeur devons-nous regarder pour déterminer si courbe de calibration acceptable ou pas ?
r2 > ou égal à 0,9900
V ou F. La relation entre abs et transmittance est directement proportionnelle
F. C’est inversement proportionnelle (plus y’a d’absorbance moins il y a de transmittance)
Formule de K
K = D.O / [concentration]
Que doit contenir le blanc ?
Tout sauf l’analyte ou autre colorant qui pourrait absorber à la longueur d’onde spécifique de l’analyte
Pourquoi faire un blanc ?
- Corriger les interférences du solvant, des réactifs ou des cuves.
- Éliminer les erreurs dues à la diffusion ou à la réflexion de la lumière.
- Étalonner l’instrument pour garantir des mesures précises.
- Améliorer la reproductibilité des résultats.
Quelles sont les unités dans la formule de Beer-Lambert ?
L’absorbance (A) est sans unité.
Le coefficient d’absorption molaire (ε) a des unités de L·mol-1·cm-1
La concentration (c) est mesurée en mol/L.
La longueur du trajet lumineux (l) est mesurée en cm.
Quelle est l’unité de la constante de la loi Beer-Lambert?
l car normalement on ne devrait pas changer de cuvette en milieu d’analyse
Quel est le but de la limite de linéarité d’une méthode ?
La lim à laquelle la concentration cesse de respecter la loi Beer-Lambert donc on perd la proportionnalité entre la concentration et l’absorption
V ou F. Un analyte peut avoir plus d’un pic dans une courbe spectrale
V. Mais le pic le plus élevé est la longueur d’onde préférentielle
Avantage et inconvénient d’une cuvette à circulation (à flux) ?
avantage = moins de contamination et plus de reproductibilité, évite sédimentation, protège éch facilement dégradé par lumière, mesure t réel
désavantage = complexe, + coûteux, besoin d’un grand vol d’Éch, erreur par effet de dilution…
Quels sont les deux modèles de détecteur à cellule photo-émissive ?
- tube photo-multiplicateur
- simple
Quelle différence principale entre cellule photoconductrice vs photo-émissive ?
Cellule photoconductrice : Change sa conductivité en réponse à la lumière, moins sensible, plus lente, utilisée pour des intensités lumineuses plus élevées.
Cellule photoémissive : Émet des électrons lorsque la lumière la frappe, plus sensible et plus rapide, utilisée pour des mesures de faible intensité lumineuse.
Le tube photomultiplicateur (PMT) peut avoir deux arrangements principaux en fonction de son détecteur. Quels sont ces arrangements ?
Mode direct : La lumière frappe directement la cathode du tube photo-multiplicateur.
Mode réflexion : La lumière est réfléchie vers la cathode, souvent utilisée dans des configurations plus spécialisées.
