serie 4 Flashcards
Recombinaison homologue (reproduction humaine)
Série d’interactions entre 2 séquences d’ADN largement homologues présentes sur 2 différentes molécules ou sur 1 même molécule, qui produit des séquences mixtes dérivées partiellement d’un parent et partiellement de l’autre parent.
Caractéristiques:
- précision (pas de gain, pas de perte de nucléotides) - efficacité
Étude de deux aspects de la recombinaison homologue:
- changements structuraux dans les molécules d’ADN - enzymes de la recombinaison
Plusieurs voies de recombinaison:
- recBCD
- recE
- recF
Mécanisme de la recombinaison Modèle de Holliday (reproduction humaine)
Le modèle classique de recombinaison homologue a été proposé par Holliday en 1964. Les brins correspondants de deux molécules double-brins homologues s’alignent, puis sont coupés. Les extrémités libres des brins coupés se croisent pour s’associer avec l’autre extrémité libre des brins. Les brins d’ADN sont alors liés de façon covalente et le point de croisement (structure de Holliday) peut alors se déplacer dans l’une ou l’autre direction, phénomène qu’on appelle migration.
La structure de Holliday peut être résolue pour générer deux types de recombinants dans des proportions équivalentes: 1) la coupure des brins qui n’ont pas été impliqués dans la recombinaison génère un ADN dont les extrémités ont été échangées. 2) la coupure des brins qui sont impliqués dans la recombinaison provoque l’échange d’un segment simple-brin homologue.
1ière étape: formation de la structure de Holliday
2ième étape: - déplacement de la structure de Holliday - échange des brins
3ième étape: résolution de la structure de Holliday
Modèle de Holliday Évidences (reproduction humaine)
Évidences génétiques
- après la méiose, les 4 chromosomes haploides sont complets - la recombinaison est réciproque
- des régions hétérologues sont formées
- à la même fréquence, on observe les « morceaux » et les
« échanges »
Évidences physiques
- observation de la forme « chi »
- le point de crossing-over est visible
- les structures « chi » ne sont retrouvées que dans les bactéries RecA+
Mécanisme de la recombinaison Modèle de Meselson-Radding (reproduction humaine)
Ceci a amené l’élaboration de modèles alternatifs, tel que celui de Meselson-Radding. Dans ce modèle, le processus de recombinaison est initiée par une coupure simple brin dans un seul des brins d’ADN (a). La césure génère une extrémité 3’-OH qui sert d’amorce à la synthèse de nouvel ADN (ligne pointillée) en utilisant le brin complémentaire comme matrice (b). L’extrémité du brin déplacée est libre et peut envahir l’autre duplex d’ADN, se pairer au brin complémentaire et ainsi provoquer le déplacement du brin homologue, créant la boucle D (c).
L’ADN de la boucle D est ensuite dégradé (d). Ceci crée une extrémité qui permet sa liaison au brin qui se réplique. Ceci crée la structure de Holliday.
(e, f) La structure de Holliday peut migrer et finalement être résolue par la coupure des brins impliqués ou non-impliqués dans la recombinaison.
Ce modèle a donc une étape de recombinaison qui est couplée à la réplication de l’ADN.
Preuve expérimentale du modèle de Holliday : Formation de co-intégrat (reproduction humaine)
Deux génomes circulaires homologues peuvent se recombiner. D’après le modèle de Holliday, une coupure simple brin est effectuée dans les 2 génomes. Les brins coupés envahissent l’autre génome et une structure d’Holliday est formée. La résolution de cette structure génère un co-intégrat si les deux brins non-impliqués dans la recombinaison sont clivés et deux cercles recombinants si les brins impliqués dans la recombinaison sont clivées.
Recombinaison homologue chez la levure
Des études plus récentes chez la levure ont montré qu’un ADN portant une délétion pouvait se recombiner et être réparé entièrement durant le processus de recombinaison. Ceci ne pouvait pas être expliqué par les modèles de recombinaison précédents et a conduit au modèle du bris double-brin.
Modèle du bris double brin (reproduction humain )
Dans ce modèle, la recombinaison est initiée par une coupure double-brin dans une des molécules d’ADN. Cette coupure est élargie par des exonucléases. Éventuellement, l’extrémité 3’-OH d’un des brins envahira l’autre duplex d’ADN, créant une boucle D. La réplication de l’ADN cause l’élargissement de la boucle D, ce qui permet à celle-ci de se pairer à l’extrémité 3’ de l’autre chromosome. La réplication de cet ADN permettra de réparer et de compléter la région manquante. Ce modèle implique 2 étapes de réplication de l’ADN.
Ce modèle génère deux structures de Holliday. Celles-ci sont résolues de façon indépendante permettant la formation de plusieurs molécules recombinantes différentes. Les coupures 2-3 et 2-4 sont montrées. Les coupures 1-3 et 1-4 sont également possibles.
Modèles Meselson-Radding et bris double-brin (reproduction humaine)
Dans le modèle de Holliday, la structure de Holliday se fait dès le début, au site d’initiation de la recombinaison.
Dans ces 2 autres modèles, dans lesquels au moins une étape de recombinaison implique la réplication de l’ADN, deux processus sont apparents. 1- La région générée lors de la réplication de l’ADN montre une recombinaison non-réciproque puisqu’un des brins est perdu et remplacé par réplication. 2- Après la formation de la structure de Holliday, il y a migration de la structure sur des distances plus ou moins grandes. Ce déplacement génère une région dans laquelle la recombinaison est réciproque puisqu’elle est causée par un déplacement de brins existants.
Recombinaison homologue chez les procaryotes
Chez les procaryotes, la recombinaison homologue est nécessaire pour la réparation des cassures bicaténaires de l’ADN, le redémarrage des fourches de réplication bloquées et la recombinaison de l’ADN chromosomique avec de l’ADN qui entre dans les cellules lors de l’infection par un bactériophage ou lors de la conjugaison.
3 étapes:
- initiation (recBDC, topoisomérase, recA) - migration (ruvAB)
- résolution (ruvC)
La recombinaison est initiée par des complexes enzymatiques (ex. recBCD) qui créent des régions d’ADNsb. La protéine recA reconnait ces sites et sert alors de matrice pour pairer les chromosomes et permettre l’échange des brins par la formation de la structure de Holliday.
La jonction de Holliday est reconnue par les protéines ruvA et ruvB qui permettent le déplacement rapide de la jonction et par ce fait l’allongement de la région recombinée.
N’importe quand après sa formation, la jonction de Holliday peut être reconnue et clivée par la protéine ruvC, libérant ainsi les deux chromosomes.
Règles d’assimilation des brins
Les activités d’appariement et d’échange de brins de recA peuvent être observées in vitro en utilisant de simples substrats d’ADN. Les propriétés importantes sont:
-La complémentarité des séquences entre les deux ADN partenaires
- une région d’ADNsb sur au moins l’une des 2 molécules
- la présence d’une extrémité d’ADN dans la région de complémentarité
Recombinaison homologue chez la bactérie
Le système que nous allons étudier porte sur la recombinaison recA dépendante de la bactérie. La recombinaison est initiée par le complexe protéique recBCD (hélicase, nucléase), effectuée par la protéine recA (échange des brins), et résolue par le complexe protéique ruvABC (migration, résolution).
Le complexe recBCD est formé des produits des gènes recB, recC et recD. Le complexe recBCD initie la recombinaison en créant des bris dans l’ADN. Le complexe “entre” dans l’ADN double-brin par une extrémité et migre de façon unidirectionnelle sur l’ADN. Lors de sa migration, le complexe enzymatique sépare les brins d’ADN localement pour produire des régions simple-brins. Ces ADNsb sont dégradés par les activités nucléasiques de recBCD. A la rencontre d’une séquence chi (GCTGGTGG), recBCD cesse la dégradation du brin ayant une extrémité 3’. Cet ADNsb est alors tapissé de la protéine recA (aidée par recBCD), ce qui initie la recombinaison.
RecBCD a besoin d’une extrémité double brin libre pour amorcer le déroulement de l’ADN. Celles-ci sont normalement absentes du chromosome bactérien circulaire. Elles sont cependant produites au cours des opérations de recombinaison provoquées par la transformation bactérienne, la conjugaison et la transduction induite par les phages. Elles apparaissent aussi lors de l’inactivation de fourches de réplication.
RecBCD
-Hélicase de l’ADN unidirectionnelle
-Exonucléase ATP-dépendante -Endonucléase ATP-stimulée
-Endonucléase à un site spécifique (5’ GCTGGTGG 3’)
RecB est une hélicase 3’ 5’ qui possède également un domaine nucléolytique multifonctionnel. RecD est une hélicase 5’ 3’. RecC reconnait les sites chi. L’activité de recBCD coupe fréquemment chacun des brins pendant le déroulement de l’ADN.
Le brin 3’ est dirigé vers recB alors que le brin 5’ est dirigé vers recD. Le brin 3’ monocaténaire émerge au niveau du site nucléolytique de recB. Il en résulte la digestion efficace et progressive de ce brin. Le brin 5’ passe également par le site nucléolytique de recB mais moins efficacement .
Lors de la rencontre d’un site chi, l’activité de recBCD est altérée. recC reconnait la séquence chi et s’y fixe fortement: l’extrémité 3’ est piégée et ne peut plus avancer vers de site de dégradation. Ceci empêche sa coupure et permet la dégradation facilitée du brin 5’.
La queue 3’ monocaténaire sera recouverte de recA pour initier la recombinaison.
REC A
RecA est la protéine centrale de la recombinaison homologue. RecA est membre d’une famille d’enzymes appelées les protéines échangeuses de brins. Ces protéines catalysent l’appariement des molécules homologues de l’ADN.
La forme active de recA est un filament protéine-ADN. La protéine recA reconnaît l’ADN simple-brin et s’y polymérise pour former un filament hélicoïdal dans lequel les réactions d’association et de recombinaison de l’ADN se produiront. La protéine recA peut donc recouvrir l’ADN simple-brin ou encore l’ADN double-brin lorsque celui-ci contient un gap simple-brin qui permet d’initier la polymérisation. Une fois le premier brin d’ADN fixé dans la crevasse le long du filament, la protéine recA peut fixer une deuxième molécule d’ADN double-brin nu. La protéine recA permet d’abord le déplacement des brins pour permettre l’appariement des régions homologues, puis l’ouverture de l’ADN double-brin et l’échange des brins homologues.
Pour former le filament, les sous-unités de recA lient l’ADN de façon coopérative. La liaison et l’assemblage de recA sont beaucoup plus rapides avec l’ADNsb qu’avec l’ADNdb, ce qui explique la nécessité de régions monocaténaires dans les substrats soumis à un échange de brins. Le filament croît par l’addition de sous-unités recA dans le sens 5’ 3’ de telle sorte que l’extrémité 3’ du brin d’ADNsb est celle qui est le plus efficacement recouverte de recA. L’échange des brins est uniquement initié lorsqu’une des deux molécules d’ADN a une extrémité 3’-OH libre. L’utilisation de cercles et de molécules linéaires homologues pour étudier la recombinaison a permis de montrer que la recombinaison est initiée par une extrémité 3’-OH libre et qu’elle ne tolère pas les régions non-homologues.
Cycle d’interaction entre recA et l’ADN
Une fois le premier brin d’ADNsb fixé dans la crevasse le long du filament, la protéine recA peut fixer une deuxième molécule d’ADN double-brin nu. L’ADN se fixe du côté du sillon mineur, par sa structure phosphodiester. Le sillon majeur est donc libre
de réagir avec un autre ADN. L’échange des brins permet la formation de la structure de Holliday. Suite à l’hydrolyse de l’ATP, les molécules recA sont libérées et libres de se réassocier à de l’ADNsb.
Modèle proposé du pairage et de l’échange des brins dans le filament recA.
L’ADN se retrouve dans une crevasse le long du
filament, lié du côté du sillon mineur par la structure
phosphodiester. Le sillon majeur est libre de réagir
avec un autre ADN.
