serie 3

Question 1

La réplication de l’ADN est semi-conservative

Answer 1

Transfert fidèle de l’information
La réplication commence en des sites particuliers appelés origine de réplication et progresse dans les deux sens jusqu’au site de terminaison. Ainsi chacun des brins d’ADN sert de matrice à la synthèse du brin-fils complémentaire.

Dans cette expérience, les bactéries poussent dans un milieu contenant du 15N, ce qui fait que tout l’ADN est « lourd ». Au temps 0, les bactéries sont transférées dans un milieu contenant du 14N et sont récoltées à différents temps, correspondant à un nombre croissant de génération (réplication). L’ADN est alors récupéré et centrifugé sur un gradient de CsCl qui permet de séparer l’ADN selon sa densité. Après un cycle de réplication, chaque molécule-fille contient un brin hérité d’un de ses parents (15N ) et un brin nouvellement synthétisé (14N), donnant naissance à une molécule d’ADN de densité intermédiaire. Avec les générations, un nombre de plus en plus grand de molécules « légères » sont visibles. La réplication de l’ADN est donc semi- conservative.

Question 2

Replication de l’ADN

Answer 2

Lors de la réplication, l’ADN polymérase ajoute un à un des nucléotides à l’extrémité 3’ d’une chaîne néoformée d’ADN. L’identité du nucléotide ajouté à la chaîne naissante est fixée par appariement de type Watson-Crick au brin matrice. L’enzyme synthétise l’ADN en catalysant la formation d’un lien phosphodiester entre le nucléotide (dNTP) entrant et la chaîne naissante.

Les ADN polymérases positionnent les nucléotides triphosphates en face d’un ADN simple brin matrice, de telle sorte que le brin néosynthétisé soit allongé dans le sens 5’  3’. Les ADN polymérases ont besoin d’une amorce dont l’extrémité est 3’-OH

Question 3

Mécanisme de réplication de l’ADN

Answer 3

Mécanisme de synthèse de l’ADN. La synthèse commence quand le 3’0OH de l’amorce déclenche une attaque nucléophile sur le phosphate α du dNTP entrant. Cela a pour conséquence l’extension de l’extrémité 3’ de l’amorce d’un nucléotide et l’élimination d’une molécule de pyrophosphate. Le pyrophosphate est hydrolysé en deux molécules de Phosphate par la pyrophosphatase.

Question 4

M13

Answer 4

Bactériophage qui possède un ADN circulaire simple-brin (+) Modèle de réplication continue de l’ADN
1ière étape :
Le bactériophage M13 contient un ADN circulaire simple-brin de type (+). Lors de l’infection, ce génome permet la synthèse d’un brin (-) complémentaire pour former un duplex de réplication.
Une amorce ARN est placée près de la structure en tige-boucle, créant une extrémité OH libre qui sert d’amorce à la synthèse de l’ADN par l’ADN polymérase III. La réplication se fait de façon continue tout au long de la molécule. L’amorce ARN est éliminée par l’ADN polymérase I et remplacée par de l’ADN. La ligase scelle la césure.

2ième étape :
La synthèse des brins (+) s’effectue selon la technique des cercles tournants
2 représentations du même mécanisme
Par la technique de réplication en cercle roulant, il y a ensuite réplication de grandes quantités de brin génomique
de type (+).
La forme réplicative double brin est
d’abord coupée pour créer une extrémité 3’-OH libre dans le brin (+). Ce groupement sert d’amorce à la synthèse du brin (+) en utilisant le brin (-) comme matrice. L’ADN polymérase peut continuer la synthèse pendant plusieurs tours (cercle roulant) pour générer de longs concatémères d’ADN simple brin (+) qui seront ensuite clivés
en génome unitaire et encapsidés dans les phages.

Question 5

φX174

Answer 5

Bactériophage qui contient un ADN simple-brin circulaire (+)Modèle de réplication discontinue de l’ADN
1ière étape :
Le bactériophage X174 contient lui aussi un génome circulaire simple-brin de type (+). Lors de l’infection, le brin (-) est synthétisé par l’action du primosome et de l’ADN polymérase III.
L’origine de réplication est d’abord reconnue par des protéines qui forment le pré-primosome. L’hélicase DnaB et la primase viennent se joindre pour former le primosome. Le complexe se déplace dans le sens contraire à la réplication de l’ADN. La primase s’arrête quelques fois pour inverser sa course et synthétiser une amorce ARN. Chaque amorce posée permet la réplication de l’ADN par l’ADN polymérase III. Les amorces sont ensuite enlevées par l’ADN polymérase I et les césures réparées par l’ADN ligase.

2ième étape :
φX174
La synthèse du brin (+) s’effectue selon une variante du mécanisme des
cercles tournants.
La technique est la même que celle décrite pour le phage M13, à l’exception que
le génome (+) néo-synthétisé est clivé à chaque tour.

Question 6

1- Initiation de la réplication

Answer 6

La réplication de l’ADN commence à un site d’initiation précis

(1) Plusieurs molécules DnaA se lient aux séquences 9-mère répétées au site d’origine de réplication. L’ADN s’enroule autour des protéines.
(2) L’enroulement de l’ADN facilite l’ouverture des brins au niveau des séquences répétées de 13 nucléotides riches en A:T.
(3) Ce complexe ouvert lie ensuite les hélicases DnaB. L’ADN peut être déroulé ce qui prépare le complexe pour l’amorçage de la réplication bidirectionnelle.
La régulation de l’initiation se fait à deux niveaux:
- La concentration et la disponibilité de la protéine DnaA
- La méthylation de l’ADN.

Question 7

La réplication de l’ADN est régulée par la quantité de DnaA-ATP et par SeqA

Answer 7

a) Avant la réplication de l’ADN, les deux brins de l’ADN sont méthylés (hexagones rouges).
b) La réplication de l’ADN fait en sorte que seul le brin parental est méthylé.
c) La protéine SeqA se lie à l’ADN hémiméthylé.
d) La présence de SeqA empêche la reméthylation du nouveau brin ainsi que la liaison de DnaA au site oriC. e) Quand SeqA se dissocie temporairement de l’ADN, la méthyltransférase Dam peut méthyler le brin néosynthétisé, ce qui empêche une nouvelle fixation de SeqA.
f) Quand les brins sont biméthylés, DnaA peut fixer le site d’origine de réplication OriC et initier la réplication.

Question 8

3- Réplication du génome bactérien

Answer 8

Une fois l’ADN dénaturé au site d’origine de réplication et les hélicases posées, chaque hélicase recrute une primase qui synthétise une amorce ARN pour commencer la synthèse des brins continus de façon bidirectionnelle. Chaque amorce est reconnue par l’ADN polymérase III et la synthèse de l’ADN commence. Dans chaque direction, quand l’hélicase a franchit environ 1000 nucléotides, une deuxième amorce ARN est synthétisée sur l’autre brin pour initier la synthèse du brin discontinu. Chaque fourche de réplication assure maintenant la réplication simultanée des deux ADN simple brin issus de l‘ADN double brin parental.

Question 9

Réplication semi-discontinue

Answer 9

Les deux brins sont répliqués simultanément.
Le brin avancé est répliqué de façon continue dans le sens 5’  3’ dans le même sens que la fourche de réplication.
Le brin retardé est également synthétisé dans le sens 5’  3’, mais d’une manière discontinue, sous la forme des fragments d’Okazaki.

Question 10

L’ADN polymérase III

Answer 10

L’ADN polymérase III, principal enzyme de la réplication assure l’allongement de la chaîne au cours de sa réplication. Elle se présente sous forme de dimères composés chacun de 10 éléments.

Question 11

L’ADN polymérase I

Answer 11

L’ADN polymérase I enlève l’amorce ARN et répare les brins d’Okasaki. Ce processus s’appelle « translation de césure ».

Question 12

L’ARN polymérase ou primase

Answer 12

L’ARN polymérase ou primase permet de synthétiser les amorces nécessaires à la réplication

Question 13

La ligase

Answer 13

La ligase catalyse la formation d’un lien phosphodiester qui scelle la césure et rétablit la continuité du brin retardé.

Question 14

2- L’ADN hélicase

Answer 14

Les ADN hélicases séparent les deux brins de la double hélice. Ce sont des complexes hexamériques adoptant la forme d’un anneau autour de l’ADN. En présence d’ATP, l’ADN hélicase se déplace sur l’ADN dans le sens 5’  3’. C’est donc dire qu’elle est liée à la matrice du brin discontinu. Son association au complexe γ de Pol III augmente son efficacité.

Question 15

Les protéines liant l’ADN simple-brin

Answer 15

La protéine dnaB permet la séparation des brins d’ADN
Les protéines fixant l’ADN simple-brin empêchent leur ré-association

Question 16

Mécanisme de synthèse de l’amorce

Answer 16

Durant la réplication par le primosome, les brins d’ADN sont séparés par l’hélicase et répliqués selon le modèle du brin avancé
et du brin retardé. Puisque l’ADN ne peut être répliqué que dans la direction 5’ vers 3’, le brin avancé est répliqué de façon continue alors que le brin retardé est répliqué au moyen des fragments d’Okasaki. La synthèse de l’ADN débute par une amorce ARN
qui est déposée par la primase.

Question 17

L’ADN polymérase III réplique l’ADN

Answer 17

L’holoenzyme Pol III est constitué de 3 domaines:
deux exemplaires du noyau et un exemplaire du complexe γ qui porte la pince coulissante.
Le complexe γ contient 2 copies de la protéine τ. Chacune relie une copie du noyau au complexe poseur de la pince coulissante.

Question 18

Coordination des 2 ADN polymérases à la fourche de réplication

Answer 18

La fourche de réplication est fixée par un complexe comprenant deux copies du noyau de Pol III qui sont liées à des pinces coulissantes et au complexe γ. L’hélicase DnaB et la primase sont associées au brin retardé.

La réplication s’effectue simultanément sur les deux brins au niveau de la fourche de réplication. L’ADN polymérase ajoute un à un des nucléotides à l’extrémité 3’ d’une chaîne néoformée d’ADN. Puisque la polymérase ajoute les nucléotides à l’extrémité 3’ de la chaîne, il y aura synthèse d’un brin avancé et d’un brin retardé. La synthèse du brin retardé est discontinue. Il est formé des fragments d’Okasaki. La primase doit synthétiser une amorce d’ARN pour que l’ADN polymérase puisse synthétiser l’ADN.

(A) L’hélicase se déplace dans le sens 5’  3’ sur la matrice du brin retardé. L’ADN Pol III est en contact avec l’hélicase. Un des noyaux synthétise le brin continu pendant que l’autre synthétise le brin discontinu. Des protéines fixent les régions simple brin. (B) Périodiquement, la primase joint l’hélicase et synthétise une amorce ARN sur la matrice du brin retardé.
(C) Quand l’ADN Pol III du brin discontinu a terminé un fragment d’Okasaki, elle se sépare de l’anneau coulissant et de l’ADN, mais reste liée au poseur d’anneaux coulissants.
(D) La région constituée par la matrice du brin discontinu et l’amorce ARN la plus récente devient la cible du poseur d’anneaux coulissants qui y dépose un nouvel anneau.
(E) L’ADN Pol III du brin discontinu prend contact avec ce nouvel anneau et commence a synthèse de l’ADN du nouveau fragment d’Okasaki.

Question 19

Balance entre réparation et réplication

Answer 19

Une mutation peut devenir définitive suite à la réplication de l’ADN si elle n’est pas réparée. Une mutation peut être introduite dans l’ADN suite à l’incorporation erronée d’une base lors d’un premier cycle de réplication. Si l’ADN n’est pas réparé, la mutation devient définitive.

Question 20

Réparation des mésappariements dus à des erreurs de réplication

Answer 20

Voie de réparation des mésappariements dus à des erreurs de réplication. MutS entoure l’ADN contenant le mésappariement et recrute MutL et MutH. L’activité ATPase de MutS catalyse l’hydrolyse de l’ATP. MutH est une endonucléase qui crée une césure près du site de mésappariement. Une exonucléase digère le brin coupé
pour enlever la région contenant le mésappariement. La brèche est alors comblée par l’ADN polymérase.

Question 21

La ligase permet de relier les fragments d’Okazaki Mécanisme d’action de la ligase

Answer 21

Par le mécanisme de remplacement des amorces d’ARN par de l’ADN, il résulte des cassures simple brin entre les fragments d’Okazaki adjacents. Les cassures sont ressoudées par une réaction catalysée par l’ADN ligase.
La réaction est couplée à l’hydrolyse de ATP  AMP + PPi
Le groupement NH2 de la lysine de la ligase se lie au phosphate α de la molécule d’ATP.
Le groupement adénosine monophosphate lié à l’enzyme interagit avec l’extrémité 5’-phosphate de l’ADN et y est transféré. L’enzyme est libérée.
Une molécule d’AMP est libérée lorsque le lien phosphodiester est créé entre les extrémités 5’-phosphate et 3’-OH au niveau de la césure de l’ADN.

Question 22

Assemblage du complexe pré-réplicatif

Answer 22

L’initiation de la réplication implique deux événements distincts: la sélection des réplicateurs et l’activation des origines.
L’assemblage d’un complexe pré-réplicatif est un processus ordonné qui commence par l’association d’un complexe de reconnaissance de l’origine (ORC) avec le réplicateur. Puis, ORC recrute au moins 2 protéines, Cdc6/Cdc18 et Cdt1. Ces trois protéines associées fonctionnent ensemble pour assembler les ADN hélicases encaryotes (complexe Mcm2-7).

Question 23

Régulation de l’activité de Cdk et formation des pré-RC pendant le cycle cellulaire

Answer 23

Pendant la phase G1, l’activité des Cdk est faible et les nouveaux pré-RC peuvent être assemblés, mais pas activés. Pendant la phase S, le niveau élevé des Cdk stimule l’initiation de la réplication et empêche tout assemblage de nouveaux complexes sur les origines filles. Le niveau de Cdk restant élevé jusqu’à la fin de la mitose, aucun nouveau complexe pré-RC ne peut être assemblé tant que.la ségrégation des chromosomes n’est pas terminée. En absence de pré-RC, la réinitiation est impossible.

Question 24

L’activation des pré-RC conduit à l’assemblage des fourches de réplication

Answer 24

Au début de la phase S, Cdk et Ddk phosphorylent des protéines de réplication pour stimuler l’initiation de la réplication. L’activation des kinases aboutit au départ de Cdc6 et Cdt1. La forme phosphorylée de Cdc6 est rapidement dégradée. Ces phosphorylations induisent le recrutement de nombreuses protéines supplémentaires, notamment les ADN polymérases. L’ADN Pol δ et l’ADN Pol ε sont d’abord recrutées, suivies de l’ADN Pol α/primase.

Question 25

Mécanisme de réplication

Answer 25

Plusieurs polymérases assurent la réplication de l’ADN chez les mammifères.
- L’ADN Pol α est étroitement associée à une primase. Elle permet la synthèse des amorces ARN de 7-10 nt, qu’elle prolonge par l’additon d’environ 15 nt ADN. La synthèse est ensuite poursuivie par l’ADN Pol δ.
-L’ADN Pol δ montre une processivité pratiquement sans limite lorsqu’associée à PCNA. Elle est impliquée dans la synthèse du brin retardé. La polymérase ε assure la synthèse du brin continu.
- Les amorces ARN sont enlevées par l’action de 2 enzymes: l’ARNase H1 enlève la plus grande partie de l’amorce ne laissant qu’un nucléotide accolé à l’extrémité 5’ de l’ADN. L’endonucléase FENI enlève ensuite ce nucléotide. FENI peut également enlever des fragments de 15 nucléotides en 5’ de l’ADN renfermant des mésappariements.

Question 26

PCNA
Antigène nucléaire de la prolifération cellulaire

Answer 26

PCNA (antigène nucléaire de la prolifération cellulaire) est l’équivalent de la pince ou anneau coulissant chez les eucaryotes. PCNA se lie à l’ADN polymérase δ et lui confère une processivité presque illimitée. PCNA joue également plusieurs autres rôles dans la cellule en s’associant à différentes protéines (voir tableau).

Question 27

Héritage des histones lors de la réplication de l’ADN

Answer 27

Durant la réplication de l’ADN, les nucléosomes présents sont répartis au hasard sur l’ADN fils. Cependant, les histones parentales sont réparties différemment. Les tétramères H3-H4 sont transférés au hasard sur l’un des deux brins fils sans se détacher de l’ADN. Les histones H3-H4 nouvellement synthétisées constituent la base des nucléosomes du brin qui n’a pas hérité du tétramère parental. Les dimères H2A-H2B vont se détacher de l’ADN et entrer en compétition dans le pool d’histones cellulaires nouvellement synthétisées. Les dimères H2A-H2B vont ensuite s’associer aux tétramères H3-H4 pour reconstituer des nucléosomes fonctionnels. Donc, en moyenne, pour chaque brin nouvellement synthétisé, un nucléosome sur deux provient du chromosome parental.

Question 28

Présence d’extrémités variables Réplication des chromosomes

Answer 28

Les chromosomes humains sont des molécules linéaires dont les extrémités appelées télomères doivent être répliquées. Les télomères forment des structures particulières qui ont deux fonctions: 1- elles permettent la réplication des extrémités, 2- elles protègent l’ADN qui ne doit pas être reconnu par la cellule comme une structure avec bris double brin (ce n’est pas une cassure de l’ADN qui doit être réparée).

Question 29

Réplication de génome linéaire : chromosome humain Télomères et télomérase

Answer 29

Les extrémités des chromosomes ne sont pas parfaitement précisées. Elles sont constituées d’un nombre élevé de copies d’une séquence d’ADN répétée qui forme les télomères.

Un mécanisme qui implique la télomérase permet d’ajouter un nombre élevé de ces unités répétitives après chaque cycle de réplication du chromosome.

La télomérase est une ADN polymérase ARN dépendante (réverse transcriptase) constituée de plusieurs sous-unités protéiques et d’un ARN. La télomérase allonge spécifiquement le 3’-OH du brin 3’ simple brin en utilisant son propre ARN comme matrice. Le résultat de ce mécanisme inhabituel est la synthèse d’ADN simple brin.

L’ARN télomérique contient une séquence complémentaire à celle de l’ADN simple brin de l’extrémité. Cette région de l’ARN télomérique peut s’apparier à l’extrémité de l’ADN simple brin et servir de matrice à la synthèse d’ADN. L’ARN se détache alors, se déplace et se ré-apparie à l’extrémité simple brin. Le cycle peut se reproduire plusieurs fois.

Question 30

Structure des télomères

Answer 30

Les télomères forment une structure en boucle.

Question 31

Importance de la télomérase

Answer 31

L’étude de la division des cellules somatiques en culture a montré que les cellules ne pouvaient se diviser qu’un nombre limité de fois. Le nombre de division est une caractéristique qui varie selon l’origine de la cellule. C’est ce qu’on appelle la limite de Hayflick. Les cellules ont donc une minuterie interne qui décompte le nombre de divisions qu’elles peuvent subir. Il semble que la télomérase soit au centre de cette minuterie. En effet, les télomères de cellules jeunes sont longs alors que ceux des cellules âgées sont plus courts. Lorsque les télomères deviennent trop courts, des séquences importantes d’ADN sont perdues lors de la réplication cellulaire et la cellule meurt. D’ailleurs, les cellules somatiques sont pour la plupart dépourvues de télomérases alors que les cellules à division rapide ou cancéreuses montrent une activité télomérique élevée. Si on réactive l’activité télomérique dans les cellules normales, on rend celles-ci immortelles.

Question 32

Liaison à une protéine Réplication de l’adénovirus

Answer 32

La réplication du génome de l’adénovirus procède par déplacement de brins, les deux brins n’étant pas répliqués en même temps.
La synthèse d’un brin commence à une extrémité et déplace l’autre brin. Lorsque la fourche de réplication atteint l’autre extrémité, le brin déplacé est relâché sous forme simple brin. Il est alors répliqué indépendamment. Il y a formation d’une tige double brin pour initier la réplication due à la présence de séquences complémentaires aux extrémités.