5- 5-Recombinaison non homologue 2024.pdf Flashcards
RECOMBINAISON SITE-SPÉCIFIQUE
-La recombinaison site spécifique est responsable de l’intégration de certains bactériophages dans le génome bactérien.
-La recombinaison est dépendante de courtes séquences spécifiques dans l’ADN du phage et de la bactérie, séquences qui sont homologues.
-L’enzyme impliquée dans cette recombinaison est spécifique pour cette paire de séquences seulement.
types de recombinaison
- 3 types différents de réarrangements: l’insertion d’un segment d’ADN, la délétion d’un segment d’ADN, l’inversion d’un segment d’ADN. Le choix dépend de l’organisation des sites de reconnaissance de la recombinase dans les molécules d’ADN et des molécules qui participent à la recombinaison. Une recombinase unique est généralement responsable de toutes les étapes.
- La recombinaison entre deux sites en répétition inversée inverse le fragment d’ADN compris entre les sites. Au contraire, la recombinaison de deux sites à répétition directe excise le fragment compris entre les 2 sites. L’insertion a lieu lorsque les sites de recombinaison impliqués sont portés par les 2 molécules différentes.
Structure de recombinaison
Chaque site de recombinaison est constitué d’une paire de séquences de reconnaissance de la recombinase, positionnées de façon symétrique. Ces séquences flanquent une courte région centrale asymétrique, la région de croisement, dans laquelle se produisent les coupures et ligatures des brins.
Des recombinases spécifiques de site coupent et ligaturent l’ADN, tyrosine et serine
Un aspect fondamental du mécanisme employé par ces deux familles de recombinases est que, lorsqu’elles coupent l’ADN, un intermédiaire covalent ADN-protéine est généré. Pour les recombinases à tyrosine, la chaîne latérale de la tyrosine situé au site actif attaque une liaison phosphodiester spécifique dans le site de recombinaison. Ceci introduit une coupure monocaténaire dans l’ADN et permet une liaison covalente entre la tyrosine et le phosphate du site coupé. De même, pour les recombinases à sérine, la chaîne latérale de la sérine au site actif de l’enzyme attaque et se lie à l’ADN.
- L’intermédiaire covalent ADN-protéine conserve l’énergie de la liaison phosphodiester. Il en résulte que les brins peuvent être ligaturés par réversion du processus de coupure. Ainsi, un groupement OH de l’ADN coupé attaque la liaison covalente qui lie la protéine à l’ADN, ce qui referme la coupure. Cette recombinaison est dite conservative car chaque liaison de l’ADN coupé pendant la réaction est refermée par la recombinase. Aucune énergie externe n’est nécessaire pour couper et ligaturer l’ADN.
- La recombinaison site-spécifique a lieu entre 2 sites de recombinaison. Chaque site de recombinaison étant constitué d’ADN bicaténaire, quatre brins d’ADN doivent être coupés puis ligaturés pour engendrer l’ADN recombiné.
Les recombinases à tyrosine coupent et ligaturent d’abord 2 brins d’ADN puis ensuite les deux autres brins.
Les recombinases à sérine coupent les 4 brins avant l’échange de brins.
Recombinaison catalysée par une recombinase à tyrosine (mecanism)
1) Dans la première étape (a), les sous-unités R1 et R3 coupent l’ADN. Les protéines sont liées à l’ADN coupé par une liaison 3’P-tyrosine.
2) L’échange de la première paire de brins a lieu quand les deux groupements 5’-OH des sites de coupures attaquent chacun la liaison ADN-protéine de l’autre molécule d’ADN (b).
3) L’échange de la deuxième paire se déroule selon le même mécanisme grâce à l’action des sous-unités R2 et R4 (c, d).
L’échange de la deuxième paire se déroule selon le même mécanisme grâce à l’action des sous-unités R2 et R4 (c, d). (mecanism)
1) Chacun des 4 brins d’ADN est coupé, dans la région de croisement, par une des sous-unités de la protéine (R1, R2, R3 et R4).
2) Les coupures des 2 brins d’une même molécule sont décalées de deux bases. Ces régions de 2 bases forment des appariements bicaténaires hybrides dans les produits recombinants.
Replication du bactériophage lambda mode lysogène
Dans le mode lysogène, une séquence d’ADN spécifique du phage, le site attP, reconnaît une séquence homologue dans l’ADN de la bactérie, le site attB, qui permet une recombinaison spécifique et l’intégration du génome viral. Le site O, qui est commun aux deux génomes, est une séquence de 15 nucléotides nécessaires pour l’échange de brins et par conséquent pour la recombinaison. Une intégrase du bactériophage et un facteur bactérien, IHF (Integration Host Factor) sont nécessaires pour l’intégration du génome phagique, alors que l’intégrase, le facteur IHF et une excisase sont nécessaires pour ressortir l’ADN phagique du site d’intégration et initier ainsi le cycle lytique.
Le modèle actuel stipule que l’intégrase (recombinase à tyrosine) fait d’abord une coupure simple brin dans les séquences POP’ et BOB’. Un échange de brins se produit pour former une structure de Holliday. Le chiasme formé migre de 7 nucléotides avant que l’intégrase ne coupe les deux autres brins pour permettre l’intégration.
Bactériophage lambda
La réplication du bactériophage lambda offre un exemple classique d’une recombinaison de type site spécifique. La réplication du bactériophage lambda peut se faire selon deux cycles: réplication virale et lyse cellulaire, ou encore intégration du génome viral dans l’ADN de la bactérie pour initier un mode lysogène
Recombinaison site-spécifique chez la Salmonelle (flagelle )
les salmonelles peuvent synthétiser deux types de flagelle, H1 et H2. Le changement d’expression d’un type de flagelle à l’autre type est médié par une inversion de l’ADN qui précède les gènes qui codent pour H2 et pour le répresseur de H1. Ce fragment d’ADN est flanqué de séquences répétées inversées et code pour une invertase. Lorsque ce fragment est dans une orientation, le promoteur de H2 et du répresseur de H1 est localisé est amont de H2 et permet la transcription de H2 et du répresseur de H1. Dans ces cellules, la flagelle H2 sera produite. Dans l’autre orientation, le promoteur est très loin du gène H2; conséquemment, ni celui-ci, ni le répresseur de H1 ne seront produits et les cellules produiront alors la flagelle H1.
TRANSPOSITION (générale)
-Contrairement aux premières croyances, le génome n’est pas statique mais au contraire peut être réorganisé, ce qui provoque des différences significatives entre les génomes de deux individus au niveau moléculaire.
-Les transposons sont des morceaux d’ADN capables de se déplacer dans le génome. Ils sont autonomes et ne requièrent pas d’homologie avec le donneur.
Ils peuvent provoquer
- l’inactivation/activation de gènes,
- le transfert de nouvelles séquences, - des réarrangements génomiques
- inversion, délétion, translocation
- introduire des mutations
-Conséquemment, - ils créent de nouvelles séquences
- - ils changent la fonction de différentes séquences
- ils sont un facteur majeur d’évolution
Insertions, inversions et délétions
La recombinaison des transposons dans le génome provoque des réarrangements importants dans
l’ADN. Des délétions, des inversions et des réarrangements peuvent être observés . Ces réarrangements peuvent être létaux pour la cellule. Le choix du mécanisme dépend de l’orientation des séquences répétées. Les séquences répétées inversées provoquent l’inversion du segment d’ADN compris entre les 2 sites alors que les séquences répétées directes provoquent sa délétion.
Transposons:bactéries
IS, TN
Transposons: eucaryotes
- ressemblent aux éléments bactériens
- rétrotransposons (intermédiaire ARN)
Caractéristique de la tansposition
Le processus de la transposition montre les caractéristiques communes suivantes:
- les transposons ont des extrémités répétées inversées
- ils codent pour leur propre transposase - ils génèrent par le mécanisme de transposition une répétition directe des séquences de l’hôte au site d’intégration.
3 types d’éléments transposables chez les bactéries
1- Éléments d’insertion (IS)
- élément simples constitués de répétitions inversées et d’un ou deux gènes nécessaires à leur transposition.Leur insertion provoque une duplication dans la séquence de l’hôte.
2- Transposons (Tn-A)
- éléments transposables qui contiennent des répétitions inversées, des gènes de transposition et des gènes non-reliés à la transposition (ex: résistance aux antibiotiques)
3- Transposons composés (Tn10, Tn5)
- séquence d’ADN variable, flanquée d’éléments IS.
Transposons composés
Les transposons composés (Tn10, Tn5) sont constitués de séquences d’ADN variables flanquées d’éléments IS à chaque extrémité.
Éléments IS
Les éléments d’insertion (IS) sont des élément simples constitués de séquences répétées inversées à chaque extrémité
et d’un ou deux gènes nécessaires à leur transposition. Leur insertion provoque une duplication dans la séquence de l’hôte.
Transposon Tn3
Les transposons (Tn) sont des éléments transposables qui contiennent des séquences répétées inversées à chaque extrémité, des gènes de transposition et des gènes non-liés à la transposition (ex: gène de résistance aux antibiotiques).
Transposition réplicative vs. Transposition non-réplicative (conservative)
La transposition réplicative crée une copie du transposon qui s’insère à un site de l’hôte. Dans ce cas, le site donneur reste inchangé et par conséquent, le donneur et la cible contiennent maintenant une copie du transposon.
Dans la transposition non-réplicative, le transposon s’excise du site donneur, existe sous forme autonome, avant de s’intégrer à un nouveau site. Le site original est donc brisé, ce qui est létal pour la cellule à moins qu’il ne soit réparé. Finalement, la transposition conservative implique le mouvement du transposon du site donneur vers le site receveur, sans perte ni gain de nucléotides. L’excision et l’intégration sont couplées.
Transposition par le mécanisme de « coupé-collé » (non-réplicatif)
un site situé dans l’ADN de l’hôte vers un nouveau site dans l’ADN. Le mécanisme implique l’excision du transposon de son site initial et son intégration dans un nouveau site.
1) La transposase se lie aux répétitions terminales du transposon et en rapproche les extrémités formant un complexe stable.
2)L’ADN du site d’insertion initial montre une coupure bicaténaire, en résultat de l’excision du transposon. La transposase coupe en premier un des brins à l’extrémité du transposon, exactement à la jonction entre l’ADN du transposon et l’ADN de l’hôte dans lequel il est inséré. La transposase coupe l’ADN de telle sorte que la séquence du transposon se termine par un groupement 3’OH à chaque extrémité. Les autres brins sont alors coupés par différents mécanismes selon le transposon.
3)Après l’excision du transposon, les extrémités 3’OH attaquent des liaisons phosphodiester de l’ADN du nouveau site d’intégration. En résultat, l’ADN du transposon est lié de façon covalente à l’ADN du site cible. Les deux extrémités 3’OH attaquent simultanément l’ADN cible. Les sites d’attaque sont séparés par quelques nucléotides, ce qui crée de courtes duplications du site cible qui encadrent le transposon.
Différents mécanismes de coupure des transposons non-réplicatifs
Trois mécanismes de coupure de brins non transférés.
A) Une enzyme autre que la transposase est utilisée.
B) La transposase catalyse l’attaque de l’un des brins de l’ADN sur l’autre brin, pour former un intermédiaire en épingle à cheveux aux deux extrémités du transposon. Les deux extrémités sont ensuite hydrolysées par la transposase.
C) Le transposon Hermes utilise un mécanisme dans lequel l’ordre des coupures est différent. Les épingles à cheveux sont formés dans l’ADN du site d’insertion et non aux extrémités du transposon.
Mécanisme d’intégration des transposons non-réplicatifs
1)Étape chimique du transfert de brin d’ADN.
2) La réaction de ligature de l’ADN se déroule par une réaction de transestérificastion en une seule étape.
3)La transposase catalyse l’attaque de l’extrémité 3’OH sur une liaison phosphodiester au site d’intégration. La coupure engendrée permet la ligastion de l’extrémité 3’OH dans l’ADN cible.
4) Une deuxième étape de transestérification à partir de l’autre extrémité du transposon sur le deuxième brin de l’ADN cible permet l’intégration du transposon.
Mécanisme de la transposition réplicative
1) Une coupure cohésive est effectuée dans l’ADN cible et des coupures simple-brins aux deux-extrémités du transposon sont générées.
2) Les extrémités libres ainsi générées sont liées, ce qui crée une fourche de réplication aux deux extrémités du transposon.
3) Le transposon est alors répliqué, ce qui forme un co-intégrat.
4) Le co-intégrat est résolu par recombinaison homologue site- spécifique entre les deux copies du transposon, ce qui génère deux plasmides qui contiennent chacun une copie du transposon. La recombinaison est effectuée par la résolvase, qui est codé par le transposon.
Régulation de la transposition
-Des mutations dans les extrémités inversées ne sont pas tolérées
-Régulation du déplacement des transposons
-IS codent une transposase et des facteurs qui inhibent le mouvement -TN10 contient deux promoteurs qui se chevauchent. Méthylation
du promoteur
-TN5 produit deux protéines « identiques » dont une est inhibitrice -TN-A produit un répresseur
- Facteurs cellulaires (polymérase, méthylase, girase etc)