Séquencage Flashcards
Sur quoi repose la majorité des techniques de séquencage ?
Sur l’utilisation d’une ADN pol, qui doit être choisie selon ses paramètres (vitesse, taux d’erreur, processivité)
Quel inconvénient pour la méthode de sanger ?
Ne lit que 600 à 800 pb : du coup pas possible de faire des gros fragments.
Que nécessite Sanger pour faire un séquencage complet ?
Il faut fragmenter le génome en petits fragments, et constituer une banque de clones. On utilise pour cela la nébulisation.
Qu’est-ce que la nébulisation ?
Il s’agit d’une méthode de fragmentation de l’ADN en induisant des coupures mécaniques aléatoires en passant l’ADN dans un capillaire. On obtient alors les fragments qui se chevauchent, nécessaires à la reconstitution du génome (pas possible avec ER)
Comment gérer la taille des fragments générés par la Nébulisation ?
En variant la pression.
Utilise-t-on les mêmes plasmides pour cloner des petits fragments et des gros fragments et ainsi obtenir la banque ?
Non, on utilise 2 différents : YAC et BAC.
Comment calculer la probabilité de trouver une séquence dans une banque de fragments d’une taille donnée pour un génome d’une taille donnée ?
N = ln 1-P / ln 1-f
Les souches de Coli utilisées pour les clonages sont mutées. Comment ?
De sorte à limiter leurs mécanismes de défense contre l’ADN exogène.
Quel est le principe de Sanger ?
On prend un ADN simple brin et la pol utilise un nucléotide amorce. Le milieu comporte des dNTP et en moindre concentration des ddNTP fluo. Les ddNTP provoquent un arrêt et on identifie les fluo pour séquencer.
Quels sont les paramètres d’un séquencage ?
Couverture et Précision.
Comment analyse on un séquencage Sanger ?
Avec de la cartographie, en établissant une carte génétique avec des ER
Quelle différence a le WGS ?
On fragmente le génome en ensemble de petits fragments, et c’est galère de remettre l’ordre. Par contre, easy séquencage.
Quel est le principe du pyroséquencage ?
On a des librairies moléculaires d’ADN amplifiés avec PCR, en les fixant sur des billes dans des gouttes d’huiles. On a théoriquement 1 fragment d’ADN par goutte. Les billes sont ensuites réparties dans des puits, avec des dNTP, puis polymérisation. Chaque ajout de Nt libère un Pyrophosphate, qui produit un ATP. l’ATP est utilisé par la luciférase, et signal lumineux.
Quel avantage et inconvénient de 454 vs Illumina ?
Génère moins de données qu’illumina mais les fragments lus peuvent être plus grands.
Décrire Illumina.
ADN fixé à des adapteurs. Puis, PCR avec des amorces sur adapteurs : crée une librairie. On dépose les fragments sur un flow cell. On fait l’amplification des fragments avec des Nt fluo, à chaque fixation un Nt spécifique de la base est libéré : on lit des points de couleurs qui donne la séquence.
