Protéomique

Question 1

Que nécessite l’analyse protéomique ?

Answer 1

D’extraire les protéines avec des paramètres différents selon leur type.

Question 2

Comment faire une extraction de protéines ?

Answer 2

On commence par une lyse des cellules et l’élimination des contaminants. On récup les prots solubles dans le surnageant. Puis, on élimine les ARN et on précipite les protéines pour éliminer sels et AG. Puis, on les met dans un tampon pour les solubiliser, légèrement détergent avec des agents chaotropiques non chargés (urée).

Question 3

Quand on extrait les protéines, comment évite-on la dégradation des protéines ?

Answer 3

On essaye de manipuler hors-air, donc sous huile.

Question 4

Donner une méthode de dosage des protéines et décrire viteuf.

Answer 4

Bradford : utilisation du bleu de coomasie qui se lie aux protéines. En parallèle, étalonnage avec du BSA.

Question 5

Qu’est-ce que la séparation à deux dimensions ?

Answer 5

On sépare les protéines selon PI et PM.

Question 6

Comment séparer selon PI ?

Answer 6

Migration sur acrylamide avec gradient de pH : les prots migrent vers anode ou catode selon pH et PI.

Question 7

Comment zoomer sur un gradient ?

Answer 7

on prend un plus petit gradient de pH.

Question 8

Comment fait on une 2e migration après celle du PI ?

Answer 8

On peut se servir du gel PI pour transférer sur un nouveau gel : il faut juste que la taille des deux gels soit adaptée.

Question 9

Dans le second gel (SDS) ou vont migrer les prots ?

Answer 9

Vers l’anode (+).

Question 10

De quelles méthodes dispose-ton pour visualiser les protéines ?

Answer 10

Colorants organiques, comme le bleu de coomasie
Réduction d’ion métallique
Marquage radioactif
colorant fluo

Question 11

Quels avantages et inconvénient de colorant organique ?

Answer 11

Faible sensibilité, spécifique et quantitatif.

Question 12

Quels avantages et inconvénient de réduciton d’ion ?

Answer 12

plus sensible, mais pas très quantitatif, et risque de louper des prots.

Question 13

Quels avantages et inconvénient de la radioactivité ?

Answer 13

Avantage c’est in vivo ou in vitro, bien sensible et bien linéraire entre signal et concentration. Par contre compliqué de l’utiliser chez êtres vivants.

Question 14

Quels avantages et inconvénient de la fluo ?

Answer 14

On peut différencier en marquant différemment deux échantillons différents. très bonne sensibilité et linéarité mais smr c’est cher.

Question 15

C’est quoi le matching ?

Answer 15

Trouver des similarités de taches entre deux gels via un logiciel et quantifier l’intensité de ces taches. Faut préciser au logiciel ce qui est des artefacts.

Question 16

Qu’est-ce que l’identification par Edman ?

Answer 16

Cela permet le séquencage d’une protéien grâce à une dérivatisation de l’acide aminé N terminal : un groupement chelou s fixe sur le NH2 terminal, et on réalise une hydrolyse de ce dernier acide aminé combiné au réactif, ce qui permet de le déterminer. On continue et au bout on chope la séquence protéique.

Question 17

A quoi sert la spectro de masse et quel est son principe ?

Answer 17

Elle sert à identifier une protéine en mesurant un ratio masse/charge après une étape d’ionisation. Les ions sont séparés par un champ magnétique ou électrique selon leur ratio.

Question 18

C’est quoi la MALDI ?

Answer 18

UNe variation de la spectro de masse avec un échantillon présent en matrice solide : cette matrice est ionisée par laser et on fait migrer les ions sur champ électrique, ou ils seront uniquement séparés par leur masse. On mesure alors le temps de vol de ces ions pour déterminer leur masse.
Ionisiation douce.

Question 19

Qu’est-ce que la MS en tandem ?

Answer 19

On fait 2 fragmentations et 2 séparation des ions, avec 2 analyseurs de masses. La comparaison des masses obtenues en MS et MS tandem permettent de déterminer la différence de poids et donc le dernier AA incorporé.

Question 20

Qu’est-ce que la technique d’empreinte moléculaire ?

Answer 20

On fait une digestion avec trypsine de la prot dans le gel (trypsin coupe que après R et K), puis MS. Puis, compare les peptides obtenus avec ceux d’une DB, et on obtient une probabilité Zscore. Si >2 : c’est probablement la bonne prot’

Question 21

quelle limite à l’empreinte ?

Answer 21

Pas adaptée aux protéines avec une faible masse moléculaire. On préfère généralement regarder les PI PM puis Edman pour confirmer les résultats.

Question 22

Comment étudier les protéines membranaires ?

Answer 22

On utilise la protéinase K : si le milieu acide, alors la membrane est partiellement dénaturée et on peut étudier les peptides en MS tandem.

Question 23

C’est quoi l’ICAT ?

Answer 23

Permet l’étude différentielle de protéines : on utilise 2 réactifs ICAT (biotinylés) pour marquer deux conditions de cultures différentes. Puis on fragmente par trypsine et on récupère les fragments grâce à l’extrémité biotinylé des réactifs ICAT, puis MS. Si 2 pics c’est exprimé dans les 2 conditions, 1 pic 1 seule condition.

Question 24

Comment marche double hybride levure ?

Answer 24

On utilise 2 prots fusionnées avec des morceaux de TF : si interaction entre les prots, les morceaux se collent et le TF est reconstitué et on obtient un signal. Rq: bcp de faux positifs.

Question 25

Quelle différence avec double hybride bactérien ?

Answer 25

On regarde l’interactionde protéines chez bactéries : du coup se base sur l’opéron lactose. Utilisation d’une cyclas, qui produit de l’AMPc quand reconstituée : active le gène LacZ et on peut le détecter.