Séparation par chromatographie

Question 1

Sur quoi est basée la chromatographie (2)?

Answer 1

1-Utilisation d’une phase mobile (contient le mélange de substances à fractionner)

2-Utilisation d’une phase stationnaire (au travers de laquelle les substances sont séparées)

Question 2

Quel est l’effet des interactions des différentes substances avec la phase stationnaire?

Answer 2

Les interactions ralentissent plus ou moins leur migration au travers de cette phase selon les propriétés respectives de chaque substance.

Question 3

Quelles sont les propriétés communément utilisées pour effectuer le fractionnement (3)? Quel est le type de chromatographie utilisé pour chacune?

Answer 3

1-Les interactions ioniques —> chromatographie par échange d’ions
2-La taille —> chromatographie par gel-filtration
3-La spécificité —> chromatographie d’affinité

Question 4

Dans un processus d’échange d’ions, les ions liés ________ à un support insoluble (R : phase stationnaire) sont remplacés de manière ________ par des ions en solution. Illustrer la réaction.

Answer 4

1-électrostatiquement
2-réversible

Réaction : R+A- + B- <——> R+B- + A-
(R+A- est un échangeur d’anions sour la forme A-)

Question 5

Qu’est-ce qu’un échangeur de cations? Et un échangeur d’anions?

Answer 5

Échangeur de cations : Il porte des groupes chargés négativement (R-) et lierait des cations de manière réversible.

Échangeur d’anions : Il porte des groupes chargés positivement (R+) et lierait des anions de manière réversible.

Question 6

Vrai ou faux : Les protéines portent soit des charges positives ou négatives et peuvent lier soit un échangeur d’anions ou de cations.

Answer 6

Faux : Les protéines portent à la fois des charges positives et négatives et peuvent lier à la fois un échangeur d’anions ou de cations.

Question 7

L’affinité avec laquelle une protéine se lie à un échangeur d’ions dépend de quoi (2)?

Answer 7

1-Du pH de la solution (puisque la charge nette des protéines varie selon le pH)

2-De la nature et des concentrations des autres ions en solution (qui vont aussi compétitionner pour les sites de liaison de l’échangeur d’ions)

Question 8

Les échangeurs utilisés en chromatographie des protéines dépendent de quelles caractéristiques importantes (2)?

Answer 8

1-La nature de leur matrice
2-Le type de groupement fonctionnel utilisé pour favoriser l’attachement de la protéine

Question 9

Que sont les matrices utilisées en chromatographie? Comment sont-elles appelées?

Answer 9

Ce sont des polymères insolubles préparés sous formes de billes appelées familièrement résines.

Question 10

Quels sont les polymères les plus souvent utilisés dans les matrices pour chromatographie?

Answer 10

Ce sont des polysaccarides comme le cellulose ou des dérivés du cellulose, de l’agarose ou autres polymères.

Question 11

Quelle est la caractéristique des polymères utilisés dans les matrices pour chromatographie qui permet la pénétration d’une protéine?

Answer 11

Ces polymères sont suffisamment poreux afin de permettre la pénétration d’une protéine et le réseau des pores génère une surface beaucoup plus large que la surface de l’extérieur de la bille.

Question 12

Qu’est-ce que les échangeurs d’ions exploitent sur la protéine à un pH donné? Qu’est-ce que cela permet?

Answer 12

Ils exploitent la présence d’une charge nette sur la protéine à un pH donné qui leur permettent d’interagir par attraction électrostatique.

Question 13

Quelles sont les deux classes d’échangeurs? Quelles sont les charges qu’ils portent?

Answer 13

1-Les échangeurs anioniques qui portent une charge positive
2-Les échangeur cationiques qui possèdent une charge négative

Question 14

Chaque classe d’échangeurs se divise en groupe dit «________» qui reste pleinement chargé entre pH __ et __ et «________» qui est chargé dans une gamme de pH plus ________.

Answer 14

-échangeur fort
- (3)
- (10)
-échangeur faible
-restreint

Question 15

Quels sont les groupements chimiques greffés sur les matrices (4)? Quelle est leur force?

Answer 15

1-QAE : amine quaternaire (N+pKa environ 9,5) —> échangeur anionique fort

2-Sulfonates —> échangeur cationique fort

3-DEAE : amine tertiaire (partiellement chargé à partir de pH 7 à 8) —> échangeur anionique faible

4-CM : carboxyméthyle (pleinement chargé à partir de pH 4,5) —> échangeur cationique faible

Question 16

Comment les protéines se lient aux échangeurs?

Answer 16

Par des forces électrostatiques entre la surface de la protéine et les groupement chargés sur l’échangeur.

Question 17

Les charges de l’échangeur sont contrebalancées par quoi? Que doit alors faire une protéine pour s’attacher?

Answer 17

Les charges de l’échangeur sont contrebalancées par des contre-ions (ions métalliques, des ions de sel, ou des ions du tampon). Une protéine doit alors déplacer les contre-ions pour s’attacher.

Question 18

Vrai ou faux : La protéine est également neutralisée par des contre-ions.

Answer 18

Vrai

Question 19

Qu’est-ce que ça fait que la protéine est neutralisée par des contre-ions?

Answer 19

La protéine doit posséder une plus grande affinité pour l’échangeur que pour les contre-ions qu’elle doit déplacer

Question 20

Comment sont choisis le pH et la concentration saline de la solution dans laquelle la protéine est dissoute?

Answer 20

Ils sont choisis de sorte que cette protéine se trouve immobilisée sur l’échangeur d’ions.

Question 21

Une fois que la solution de protéines est appliquée sur le haut de la colonne contenant l’échangeur, qu’est-ce qui doit être fait?

Answer 21

On doit laver la colonne avec une solution tampon.

Question 22

Expliquer comment les différentes protéines se lieront à l’échangeur d’ions avec des affinités différentes.

Answer 22

-Les protéines ayant une affinité relativement faible pour l’échangeur d’ions migreront plus rapidement dans la colonne que celles qui lient l’échangeur avec une plus forte affinité.

Question 23

Plus l’affinité de liaison d’une protéine pour l’échangeur est ______, plus la migration sera ______.

Answer 23

-forte
-retardée

Question 24

Qu’est-ce que le procédé d’élution fractionnée?

Answer 24

Les protéines liées à l’échangeur d’ions peuvent être éluées par un tampon de concentration saline supérieure au tampon de lavage. Ainsi, avec plusieurs lavages, différentes protéines sont recueillies selon leur affinité avec la résine. Le tampon à forte concentration saline permet la migration de la protéine d’intérêt plus rapidement.

Question 25

Normalement, le ____ ou le ____ sont utilisés pour l’élution.

Answer 25

-KCl
-NaCl

Question 26

Qu’est-ce qui déplace directement la protéine dans la colonne d’élution? Comment?

Answer 26

Le sel déplace directement la protéine : les ions occupent les sites chargés devenus disponibles et bloquent le rattachement de la protéine.

Question 27

Qu’est-ce que le procédé d’élution par gradient? Quel est son avantage?

Answer 27

C’est l’utilisation d’un gradient linéaire, où la concentration saline de la solution d’élution varie de façon linéaire avec le volume qui passe dans la colonne. Elle permet de libérer, les unes après les autres, les différentes protéines liées à l’échangeur d’ions selon leur affinité. C’est un type d’élution plus fin/spécifique.

Question 28

Comment sont séparées les molécules dans la chromatographie par gel-filtration ou tamis moléculaire?

Answer 28

Les molécules sont séparées selon leur taille et leur forme.

Question 29

Quels sont les principes de la chromatographies par gel-filtration (3)?

Answer 29

1-La phase stationnaire (résine) consiste en un réseau de polymères réticulé possédant des pores, fabriqué sous forme de billes.

2-Les pores dans les billes du gel sont suffisamment grands afin de permettre la pénétration complète des petites molécules, mais ils ne laissent pas pénétrer toutes les protéines à partir d’une certaine taille (limite d’exclusion).

3-Les protéines qui ne pénètrent pas dans les pores traversent la colonne plus rapidement que les protéines retenues dans les pores des billes.

Question 30

Comment sont faites les matrices utilisées dans la chromatographie par gel-filtration?

Answer 30

Les matrices sont faites de polymères insolubles à base de polysaccarides comme le d’extrane (Sephadex) ou l’aggarose (Sépharose) ou de polyacrylamide (Bio-Gel), préparées sous la forme de billes réticulées (poreuses).

Question 31

Vrai ou faux : Dans des conditions optimales (chromatographie par gel-filtration), toutes les pores sont accessibles aux protéines et n’importe quelle taille de protéines peuvent y accéder.

Answer 31

Faux : Dans des conditions optimales (chromatographie par gel-filtration), toutes les pores sont accessibles aux protéines, mais pas n’importe quelle taille de protéines peuvent y accéder.

Question 32

La porosité des gels dépendra de quoi (2)?

Answer 32

1-De la masse moléculaire du polymère
2-Du nombre de liaisons croisées qui se forment entre les molécules du polymère (pontage)

Question 33

Comment exprime-t-on la masse des protéines?

Answer 33

En kilodaltons (kDa)

Question 34

Qu’est-ce que la limite d’exclusion?

Answer 34

C’est la limite de taille que certaines protéines ne peuvent pas pénétrer dans les pores des billes du gel.

Question 35

Comment sont les meilleures billes de gel?

Answer 35

Ce sont celles qui ont des tailles de pore qui excluent 90% des macromolécules qui possèdent 5 à 6 fois la taille des macromolécules retenues dans le volume interstitiel des billes (limite d’exclusion).

Question 36

Expliquer en résumé la chromatographie par gel-filtration.

Answer 36

Principe de filtration sur gel afin de séparer des protéines de tailles différentes sur une colonne. Les protéines de grandes tailles sont exclues de la plupart de pores, et par conséquent se déplacent avec le front du tampon. Les petites protéines rentrent/sortent dans les pores ce qui les ralentis. Plus les molécules restent longtemps dans les pores, elles sont plus petites et donc récupérées plus tard.

Question 37

Qu’est-ce que le volume d’élution d’une protéine? Comment peut-il être déterminé?

Answer 37

C’est le volume de solvant nécessaire pour éluer la protéine après son dépôt sur la colonne. On mesure le volume d’un tube (ex: 1 mL) et on compte le nombre de tube que cela a pris pour extraire la protéine d’intérêt (ex: 5 tube avant alors volume d’élution = 5mL).

Question 38

Qu’est-ce que le volume d’élution relatif d’une protéine? Comment peut-il être déterminé?

Answer 38

C’est une caractéristique propre aux protéines. Cette mesure permet d’estimer la masse moléculaire d’une protéine. Cela représente le volume d’élution (Ve)/le volume mort (Vo : volume de solvant qui entoure les billes).

Question 39

Vrai ou faux : Il est possible d’estimer la masse d’une protéine inconnue en connaissant son volume d’élution relatif.

Answer 39

Vrai

Question 40

Que permet la dialyse?

Answer 40

Elle permet de séparer les molécules selon leurs tailles grâce à l’utilisation de membranes semi-perméables qui présentent des pores de taille inférieure aux protéines.

Question 41

Que permettent les pores de membranes semi-perméables dans la dialyse?

Answer 41

Elles permettent aux petites molécules, comme les sels et les métabolites, de diffuser au travers de la membrane, mais empêchant la diffusion de plus grosses molécules.

Question 42

Les membranes utilisées dans la dialyse sont à base de quoi?

Answer 42

Elles sont à base de cellophane (cellulose).

Question 43

La dialyse est une technique fréquemment utilisée pour quoi?

Answer 43

Pour éliminer les sels présents dans un échantillon de protéine obtenu après précipitation (salting out) ou après élution avec un tampon riche en sels d’une colonne de chromatographie par échange d’ions.

Question 44

La solution de protéines et de sels est mise à l’intérieur d’un sac à dialyse, puis immergée dans un large volume tampon. Après plusieurs heures, que se passe-t-il avec les solutions?

Answer 44

Les solutions se retrouveront à l’équilibre grâce à la diffusion des sels de l’intérieur du sac vers le tampon de dialyse.

Question 45

La centrifugation sur colonne-filtre est une forme de quoi? Qu’est-ce qu’elle utilise?

Answer 45

C’est une forme de dialyse. Elle utilise une membrane poreuse pour séparer les protéines selon leur poids moléculaire.

Question 46

Qu’est-ce qui dicte la limite d’exclusion des protéines?

Answer 46

La taille des pores

Question 47

Qu’est-ce qu’un ligand?

Answer 47

C’est un composé qui lie spécifiquement la protéine d’intérêt.

Question 48

Dans la technique de chromatographie d’affinité, il y a utilisation d’un ligand. Comment est-il fixé?

Answer 48

Il est fixé de manière covalente à une matrice poreuse et inerte.

Question 49

Comment fonctionne la chromatographie d’affinité?

Answer 49

Quand une solution contenant un mélange de protéines traverse la colonne, la protéine d’intérêt se liera au ligand immobilisé, alors que les autres protéines ne s’y lieront pas et sortiront de la colonne.

On peut alors récupérer la protéine désirée sous une forme très pure en modifiant les conditions d’élution pour faire en sorte que la protéine se détache du ligand.

Question 50

Comment modifier les conditions d’élution pour faire en sorte que la protéine se détache du ligand (4)?

Answer 50

1-En ajoutant un excès de ligand libre dans la colonne (celui-ci entre en compétition pour la liaison de la protéine)
2-En changeant le pH
3-En changeant la force ionique
4-En changeant la température

Question 51

Quels sont les avantages de la chromatographie d’affinité (2)?

Answer 51

1-Cette approche possède le grand avantage d’exploiter le propriétés biochimiques uniques de la protéines d’intérêt, au lieu d’utiliser des propriétés physico-chimiques qui sont aussi partagées par d’autres protéines.

2-Pouvoir purifier la protéine d’intérêt à un très haut degré de pureté en une seule étape.

Question 52

Qu’est-ce que la constante de dissociation (Kd)?

Answer 52

C’est une mesure de l’affinité protéine-ligand.

Question 53

Qu’est-ce qui est important lorsqu’un ligand est couplé à une matrice?

Answer 53

La liaison du ligand sur la matrice ne doit pas interférer dans l’interaction protéine-ligand.

Question 54

De quoi dépendra la quantité de protéine retenue sur la colonne (Protéine-Ligand-Matrice) (3)?

Answer 54

1-Du Kd (l’interaction est trop faible si la valeur > 10^-4 M)
2-De la concentration de protéine dans l’extrait
3-Du degré de liaison du ligand à la matrice (concentration de L-M)

Question 55

Caractéristiques de la matrice utilisée pour la chromatographie d’affinité (3)?

Answer 55

1-Chimiquement inerte
2-Avoir une grande porosité
3-Présenter de nombreux groupes fonctionnels capables de former des liens covalents avec les ligands.

Question 56

Quel est le polymère le plus fréquemment utilisé pour une matrice de chromatographie d’affinité?

Answer 56

L’agarose

Question 57

Quelles sont les étapes de la liaison par lien de covalence du ligand sur la matrice d’agarose (chromatographie d’affinité) (2)?

Answer 57

1-Réaction de l’agarose avec du bromure de cyanogène, qui produit un intermédiaire «activé» et stable

2-Le ligand réagit avec l’agarose activé pour donner un produit lié par covalence

Question 58

Plusieurs protéines sont incapables de se lier à la matrice-ligand couplé de bromure de cyanogène. Pourquoi? Comment éviter ce problème?

Answer 58

À cause d’interférence stérique avec la matrice d’agarose. Pour éviter ce problème, un bras espaceur souple est ajouté entre la matrice et le ligand.

Question 59

Combien de carbones possède un bras espaceur?

Answer 59

Au moins 6.

Question 60

Lorsqu’on purifie une ou des protéines par chromatographie, il faut une méthode qui permette de la ou les détecter quantitivement et spécifiquement dans les différentes fractions de l’éluat. Quelles sont ces méthodes (5)? Quelles sont les particularités de chacune?

Answer 60

1-Absorption des protéines dans l’UV : avec un spectrophotomètre. Les protéines absorbent la lumière autour de 280 nm. Méthode non spécifique.

2-Essai colorimétrique (essai de Bardford) : contient un produit qui, en réagissant avec les protéines, donne une couleur mauve à la solution —> l’intensité de la couleur est proportionnelle à la concentration de protéine en solution. Méthode non spécifique.

3-Essai enzymatique : pratique si la protéine à purifier est une enzyme.

4-Détection de la protéine sur gel SDS-PAGE (avec un colorant) : permet de déterminer le degré de pureté de la protéine.

5-Détection de la protéine avec un anticorps (essai ELISA ou immunoblot) : très spécifique.