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BCM 1521 > Électrophorèse > Flashcards

Électrophorèse Flashcards

1
Q

Qu’est-ce que l’électrophorèse?

A

C’est la migration d’un ion dans un champ électrique.

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Q

Dans quoi est utilisée l’électrophorèse?

A

Elle est utilisée dans les séparations analytiques des molécules biologiques.

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3
Q

Qu’est-ce qu’il faut pour qu’une molécule puisse migrer dans un champ électrique?

A

Il faut que la force électrique soit plus grande que la force de friction.

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4
Q

Quelle est l’équation de la force électrique selon les lois de l’électrostatique?

A

F électrique = q*E
q étant la charge d’un ion et E l’intensité du champ électrique

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5
Q

Quelle est l’équation de la force de friction selon les lois de l’électrostatique?

A

F friction = vf
v étant la vitesse de migration et f le coefficient de friction

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6
Q

Que représente le coefficient de friction?

A

Le coefficient donne une mesure de la résistance exercée par la solution sur l’ion pendant sa migration.

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7
Q

Le coefficient de friction dépend de quoi (3)?

A

-De la taille
-De la forme de l’ion
-De la viscosité de la solution

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8
Q

Vrai ou faux : Les forces électrique et de friction s’opposent.

A

Vrai (la force électrique va dans le même sens que le champ électrique)

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9
Q

Chaque ion se déplace avec une vitesse caractérisée par quoi?

A

Par une mobilité électrophorétique

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10
Q

Au point isoélectrique (q=0), les protéines possèdent une mobilité électrophorétique ______.

A

Nulle

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11
Q

Quelle est la méthode d’électrophorèse la plus couramment utilisée?

A

L’électrophorèse en zones

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12
Q

Qu’est-ce que l’électrophorèse en zones?

A

C’est une technique dans laquelle l’échantillon est contraint à se déplacer dans une phase solide, comme le papier filtre, la cellulose ou un gel.

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13
Q

Quels sont les avantages de l’électrophorèse en zones (2)?

A

1-On élimine largement l’agitation provoquée par la convection, un facteur limitant du point de vue résolution

2-Cette technique requiert une quantité faible de matériel permettant ainsi la migration des composantes en bandes discrètes

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14
Q

Quel type d’électrophorèse constitue la technique parmi les plus puissantes et les plus faciles à utiliser dans la séparation des macromolécules?

A

L’électrophorèse sur gel

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15
Q

Quels gels d’usage commun possèdent des pores de la taille des protéines à séparer (2)?

A

L’agarose et le polyacrylamide

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16
Q

Sur quoi est basée la séparation moléculaire dans l’électrophorèse sur gel?

A

Elle est basée sur la mobilité électrophorétique des molécules et sur le principe de filtration sur gel.

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17
Q

Dans les gels d’électrophorèse, la migration des molécules larges est _______ par rapport aux molécules plus petites. Pourquoi?

A

-Retardée
Car il n’y a pas d’espaces pour le solvant entre les billes de gel (contrairement dans la filtration par gel)

18
Q

Quel est le deuxième nom de l’électrophorèse en gel polyacrylamide? Que signifie-t-il?

A

PAGE : PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

19
Q

Que signifie le pourcentage de polyacrylamide dans les gels pour l’électrophorèse en gel de polyacrylamide?

A

La quantité en pourcentage de polyacrylamide contrôle la grosseur des pores du gel.

20
Q

Description des étapes de l’électrophorèse par gel de polyacrylamide (4)

A

1-Avant que le mélange réactionnel n’ait durci, il est coulé dans un récipient formé par deux plaques de verres et polymérisera en une couche mince de gel de quelques millimètres.

2-Les échantillons sont déposés dans des puits préformés au sommet du gel.

3-Le tampon est le même dans les réservoirs du haut et du bas (pH= 9 pour que toutes les protéines aient une charge négative).

4-Un courant continu de 100 à 200 volts parcourt le gel pendant la durée de la migration.

21
Q

Vers où les protéines migrent-elles? Selon quoi?

A

Vers l’anode (+) (vers le bas) selon leur ratio charge/masse.

22
Q

Vrai ou faux : Dans un gel polyacrylamide, plus le gel est long, moins bonne est la finesse des bandes et la résolution.

A

Faux : Dans un gel polyacrylamide, plus le gel est long, meilleure est la finesse des bandes et la résolution.

23
Q

Qu’est-ce que l’électrophorèse en pH discontinu?

A

C’est un type d’électrophorèse qui utilise deux gels ayant chacun un pH propre.

24
Q

Quels sont les deux gels utilisés en électrophorétique en pH discontinu?

A

1-Un gel de séparation (running gel) préparé comme un gel de polyacrylamide (pH = 9)

2-Un gel de concentration (stacking gel) qui surmonte le gel de séparation et qui est de plus haute porosité (pH de 2 unités de moins que le gel de séparation donc 7)

25
Q

Vrai ou faux : Dans l’électrophorèse en pH discontinu, le tampon dans le réservoir du bas et celui du gel de séparation sont identiques.

A

Vrai

26
Q

Quelles sont les étapes de l’électrophorèse en pH discontinu (3)?

A

1-pH = 6,8 : la glycine est de charge neutre ce qui augmente la résistance au courant électrique. Selon la loi d’Ohm (E = IR), une résistance R plus élevée, avec un courant constant I résulte en une augmentation du champ électrique E. Il y a donc augmentation de la vitesse de migration des protéines.

2-Le passage d’un gel moins concentré à un gel plus concentré en acrylamide ralenti la migration électrophorétique à la jonction des deux gels. Il y a compaction des protéines en fines bandes.

3-pH = 8,8 : la glycine devient chargé négativement donc la résistance électrique R diminue ce qui implique une diminution du champ électrique E. Il y a diminution de la vitesse de migration des protéines et séparation des protéines en fonction du ratio charge/masse.

27
Q

Comment sont retardées les protéines qui entrent dans le gel de séparation lors de l’électrophorèse en pH discontinu?

A

Elles sont retardées selon leurs tailles par l’effet de filtration du gel :

-Les petites protéines migrent plus rapidement
-Les grosses protéines migrent plus lentement

28
Q

Vrai ou faux : Dans l’électrophorèse en pH discontinu, l’important est que la réduction dans les bandes macromoléculaires en rentrant dans le gel de séparation augmente de façon très significative la résolution du point de vue de la séparation des macromolécules.

A

Vrai

29
Q

Quelles est la méthode la plus répandue parmi les techniques biochimiques afin de déterminer la pureté d’une protéine?

A

Les gels SDS-PAGE

30
Q

La technique des gels SDS-PAGE dépend de quoi?

A

Elle dépend du fait que certains savons ou détergents, par le biais de leurs interactions hydrophobes, sont capables de dénaturer la structure d’une protéine.

31
Q

Quel est l’un des détergents les plus puissants pour dénaturer la structure d’une protéine?

A

Le sodium docecyl sulfate (SDS)

32
Q

Quelle est la force de liaison entre le SDS et les protéines?

A

Le SDS se lie de façon importante aux protéines; une concentration de 0,1% de SDS est suffisante pour saturer par sa liaison avec une chaîne polypeptides à un taux de 1 molécule de détergent par 2 résidus d’acides aminés.

33
Q

En présence de SDS, qu’arrive-t-il aux protéines contenant des sous-unités?

A

Les protéines contenant des sous-unités sont désunies et la chaîne polypeptide de chaque sous-unité adopte une conformation étendue (pas de repliement).

34
Q

Vrai ou faux : La forte charge négative globale apportée par le SDS ne peut masquer la charge intrinsèque des protéines.

A

Faux : La forte charge négative globale apportée par le SDS masque la charge intrinsèque des protéines.

35
Q

De quoi dépendra la séparation électrophorétique du gel avec du SDS? Pourquoi?

A

Elle dépendra uniquement du phénomène de gel-filtration par les pores du gel car le rapport charge/masse sera le même pour toutes les protéines de même masse.

36
Q

Vrai ou faux : La méthode de gel SDS-PAGE donne la meilleure résolution et les bandes sont les plus résolues de toutes les méthodes d’analyse.

A

Vrai

37
Q

Quels sont les avantages du gel SDS-PAGE par rapport à l’électrophorèse ordinaire (2)?

A

1-L’utilisation de SDS dissous les agrégats et les particules insolubles qui peuvent causer des problèmes en bloquant les pores du gel.

2-La mobilité électrophorétique possède une relation directe avec le poids moléculaire.

38
Q

Que peut-on obtenir quant à la relation entre la mobilité électrophorétique et le logarithme du poids moléculaire en gel SDS-PAGE?

A

On obtient une relation linéaire décroissante (plus le poids est petit, plus grande est la mobilité).

39
Q

Différence entre l’électrophorèse PAGE et l’électrophorèse SDS-PAGE

A

-PAGE : faible résolution (dépend de la longueur du gel), migration en fonction du ratio charge/masse, pas de dénaturation des complexes protéiques, pas de dénaturation des agrégats protéiques

-SDS-PAGE : excellente résolution, migration linéaire avec le logarithme de la masse moléculaire des protéines, dénaturation des complexes protéiques, dénaturation des agrégats protéiques

40
Q

Que faut-il faire lorsque la migration des protéines dans le gel est terminée?

A

Il faut visualiser les bandes obtenues par les protéines.

41
Q

Quelles sont les différentes approches pour visualiser les bandes sur les gels (3)? Que vont détecter ces approches?

A

-La coloration avec le bleu de Coomassie brillant
-La coloration au nitrate d’argent
-L’autoradiographie (si les protéines sont marquée avec un isotope radioactif comme le S35 ou le C14)

Ces approches vont détecter toutes les protéines sur le gel.

42
Q

Quelle est l’approche plus spécifique pour détecter la protéine d’intérêt?

A

L’immunobuvardage ou Western blot : consiste à détecter la protéine d’intérêt avec un anticorps qui reconnaît cette protéine

BCM 1521 (6 decks)

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