Manipulation de l’ADN Flashcards
Quels polymères forment les acides nucléiques?
L’ADN et ARN
Les acides nucléiques sont composés de 4 nucléotides. Quels sont-ils?
Pour l’ADN : A, C, G et T
Pour l’ARN : A, C, G et U
Quelles sont les propriétés physico-chimiques utilisées pour purifier les acides nucléiques (3)?
-Polymères dont la taille varie avec le nombre de nucléotides
-Composés d’une forte charge négative
-Adoptent une structure en double brins
Pourquoi l’ADN est très soluble dans l’eau?
Molécule très chargée et peu de groupements hydrophobes
Comment varie la solubilité de l’ADN?
Comme pour les protéines, sa solubilité variera avec les conditions salines et/ou la présence de substances organiques dans l’eau.
Quelle est la façon habituelle de précipiter l’ADN pour le concentrer ou changer son tampon?
La précipitation à l’éthanol
*Possible d’utiliser l’isopropanol aussi comme solvant organique
Qu’est-ce que l’extraction de l’ADN au phénol?
C’est une méthode de partition de phase dans laquelle les acides nucléiques sont retrouvés dans la phase aqueuse et les protéines, pour la plupart dénaturées, partitionnent dans le phénol, la phase plus dense, et à l’interface des deux phases.
À quelle valeur le pH du phénol doit être ajusté lors de l’extraction de l’ADN au phénol?
À un pH de 8 (l’ADN est partiellement soluble dans le phénol acide)
Qu’est-ce qui est fréquemment utilisé pour dégrader les protéines et faciliter leur extraction au phénol?
Des protéinases telle que la protéinase K
Puisque les acides nucléiques sont des molécules possédant une ________, elles peuvent migrer dans _______, comme les protéines.
-charges négative
-un gel d’électrophorèse
Que cause la grande taille des acides nucléiques lors de l’utilisation de gels de polyacrylamide?
Les acides nucléiques pénètrent difficilement dans les gels. Ces gels sont utilisés pour la purification ou l’analyse d’acides nucléiques.
Qu’utilise-t-on habituellement pour purifier et analyser les acides nucléiques?
Les gels d’agarose
Quelles sont les étapes de l’électrophorèse de l’ADN (3)?
1-L’ADN est chargé dans les puits du gel et migrera vers l’anode lors de l’électrophorèse
2-On utilise un tampon contenant de l’EDTA pour inhiber l’activité des nucléases qui peuvent être présentes dans la solution. Le pH du tampon est autour de 8.
3-Comme pour les protéines, la séparation s’effectuera selon la masse moléculaire de l’ADN, qui dépend de la taille des fragments d’ADN : fragments petits migrent plus rapidement que les grands.
Qu’est-ce qui est utilisé pour colorer les bandes d’ADN dans les gels d’électrophorèse? Pourquoi?
Des colorants comme le bromure d’éthidium : ce sont des molécules aromatiques cationiques plantaires qui s’intercalent entre les bases. Lorsqu’elles sont intercalées, elles fluorescent plus intensément qu’à l’état libre.
Quelles sont les techniques de chromatographie utilisées pour la purification des acides nucléiques (3)?
-Chromatographie par échange d’ions : puisque l’ADN et l’ARN sont de charge négative, un échangeur anionique sera utilisé. Surtout utilisée pour purifier des oligonucléotides.
-Filtration sur gel : Surtout utilisée pour dessaler des oligonucléotides.
-Chromatographie d’affinité : utilisée pour purifier les ARNm des cellules eucaryotes
