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BCM 1521 > Isolation des protéines > Flashcards

Isolation des protéines Flashcards

1
Q

Quelle est la première étape dans la purification des protéines?

A

Les dissoudre dans une phase liquide

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Q

En général, de où les protéines doivent-elles être libérées?

A

Des cellules où elles se trouvent

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Q

Quelle est la méthode la plus douce et la plus simple pour dissoudre les protéines?

A

La lyse osmotique

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4
Q

Qu’est-ce que la lyse osmotique?

A

C’est un méthode où les cellules sont resuspendues dans une solution hypotonique.

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Q

Qu’est-ce qu’une solution hypotonique?

A

Solution dont la concentration molaire en solutés est inférieure à la concentration molaire à l’intérieur de la cellule

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6
Q

Que permet la différence de concentration dans une solution hypotonique utilisée dans la lyse osmotique?

A

Elle résulte dans l’établissement d’une pression osmotique qui provoque le gonflement puis l’éclatement de la cellule.

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7
Q

La lyse osmotique est une méthode particulièrement efficace avec qui? Pourquoi?

A

Avec les cellules animales (qui ne possèdent pas de paroi cellulaire)

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8
Q

Avec des cellules bactériennes, de levures ou végétales, l’utilisation de quoi est nécessaire pour la lyse osmotique? Pourquoi?

A

L’utilisation de l’enzyme lysozyme est nécessaire pour dégrader les parois cellulaires.

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9
Q

La plupart des tissus exigent cependant une ________ afin de briser les cellules et permettre __________.

A

1-désintégration mécanique
2-l’accès à leur contenu interne

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10
Q

Quelles sont les techniques utilisées pour la désintégration mécanique (5)?

A

1-Broyage avec du sable de l’alumine ou des billes de verre de petite taille
2-Déchiquetage mécanique (blender de type Waring)
3-Homogénéisateur (Potter en Téflon)
4-Rupture par haute pression (French press)
5-Sonication par vibration ultrasonique

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11
Q

Une fois les cellules brisées, qu’est-ce qui peut être obtenu?

A

Le lysat (débris cellulaires + contenu de la cellule)

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12
Q

Que peut-on effectuer avec le lysat?

A

Le lysat obtenu peut être filtré ou centrifugé afin d’enlever les particules ou débris cellulaires, laissant ainsi la protéine d’intérêt dans le surnageant de la solution.

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13
Q

Qu’est ce qu’une centrifugation différentielle?

A

C’est une centrifugation qui permet de séparer les organites dans un même échantillon selon leur poids moléculaire en répétant des centrifugations.

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14
Q

Chaque organites peut être identifié par certains ________.

A

Marqueurs moléculaires

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15
Q

Qu’est-ce qu’un marqueur moléculaire?

A

C’est une protéine qu’on associe à un organite —> si la protéine est présente alors l’organite est présent.

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16
Q

Vrai ou faux : L’intégrité structurale des protéine et leur stabilité dépendent d’aucun facteurs.

A

Faux : Ils dépendent de plusieurs facteurs.

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17
Q

Quels sont les facteurs dont les protéines dépendent pour garder leur structure et leur stabilité (3)? Expliquer chacun.

A

-pH : utilise des solutions tampon qui maintiennent le pH dans une zone «physiologique» (6,5 à 8) pour éviter d’endommager les protéines par des variations brusques de pH.

-Température : les protéines sont facilement dénaturées à hautes températures. Plusieurs protéines se dénaturent lentement lorsqu’elles sont conservées à 25°C. La purification des protéines se fait normalement à des températures proches de 0-5°C. Une fois purifiées, les protéines peuvent se conserver à long terme à des températures de -20 à -80°C.

-Protéases : les cellules contiennent des protéases (enzymes qui hydrolysent les liens peptidiques). Ces protéases sont libérées lors de la lyse cellulaires et peuvent dégrader les protéines lors de la purification. L’ajout d’inhibiteurs de protéases permet d’empêcher cette dégradation.

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18
Q

Les protéines sont purifiées par quoi?

A

Par des méthodes de fractionnement

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19
Q

Qu’est-ce qu’on utilise pour isoler progressivement la protéine étudiée des autres substances cellulaires?

A

On utilise les différentes propriétés physico-chimiques de la protéine étudiée.

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20
Q

Quelles sont les propriétés physico-chimiques exploitées dans les différentes techniques de séparation (4)?

A

-La solubilité
-La charge ionique
-La taille moléculaire
-Les propriétés d’adsorption et de liaison à d’autres molécules biologiques

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21
Q

Quelle est la technique de séparation qui exploite la solubilité comme propriété physico-chimique?

A

La précipitation

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22
Q

Quelles sont les techniques de séparation qui exploite la charge ionique comme propriété physico-chimique (3)?

A

-La chromatographie par échange d’ions
-L’électrophorèse
-La focalisation isoélectrique

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23
Q

Quelles sont les techniques de séparation qui exploite la taille moléculaire comme propriété physico-chimique (3)?

A

-L’ultracentrifugation
-La chromatographie par gel-filtration
-L’électrophorèse

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24
Q

Quelle est la technique de séparation qui exploite la spécifité (capacité de se lier à d’autres molécules) comme propriété physico-chimique?

A

La chromatographie d’affinité

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25
Q

Quelle est l’approche couramment utilisée pour purifier une ou des protéines?

A

Les précipiter (diminuer sélectivement leur solubilité dans l’eau)

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26
Q

Vrai ou faux : La distribution des résidus d’acides aminés de types hydrophobes à la surface des protéines est plus importante dans la solubilité des protéines que les résidus de type polaires ou chargé.

A

Faux : La distribution des résidus d’acides aminés de types hydrophobes à la surface des protéines est AUSSI importante dans la solubilité des protéines que les résidus de type polaires ou chargé.

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27
Q

Qu’est-ce que la structure primaire des protéines?

A

Séquence en acides aminés de la chaîne polypeptidique

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28
Q

Qu’est-ce que la structure secondaire des protéines?

A

Hélice

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29
Q

Qu’est-ce que la structure tertiaire des protéines?

A

Repliement de la séquence polypeptidique

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30
Q

Qu’est-ce que la structure quaternaire des protéines?

A

Oligomérisation des polypeptides

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31
Q

De quoi est formée l’hémoglobine?

A

L’hémoglobine est un hétéro-tétramère constitué de deux polypeptides alpha et deux polypeptides bêta.

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32
Q

Différence entre hétéro-tétramère et homo-tétramère

A

Hétéro-tétramère : Possède deux paires différentes de sous-unités identiques

Homo-tétramère : Possède quatre sous-unités identiques

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33
Q

Vrai ou faux : Les régions non-polaires constitueraient plus de 50% de la surface des protéines globulaires.

A

Vrai

34
Q

De quoi dépend la solubilité d’une protéine (3)?

A

1-Des interactions polaires avec le solvant (attraction)
2-Des interaction ioniques avec les sels en solution (attraction)
3-Des forces électrostatiques répulsives entre molécules ou agrégats de charge similaire (répulsion)

35
Q

Quel est l’effet des facteurs de solubilité d’une protéine?

A

Augmentent les interactions avec la solution et diminuent les interactions protéines-protéines, empêchant l’agrégation des protéines

36
Q

Qu’est-ce qu’exige la précipitation?

A

Elle exige la formation d’agrégats de protéines

37
Q

Qu’est-ce qui mène à la précipitation?

A

À partir d’une certaine taille d’agrégats, la force de solubilité n’est pas suffisante pour contrecarrer celle de la force gravitationnelle, ce qui mène à la précipitation.

38
Q

Vrai ou faux : Le solvant utilisé dans l’isolement des protéines est toujours aqueux.

A

Vrai

39
Q

Qu’est-ce qui peut être changé dans le solvant aqueux pour que la solubilité d’une protéine soit modifiée?

A

Les propriétés du solvant

40
Q

Quelles sont les variations typiquement utilisées pour diminuer la solubilité d’une protéine (4)?

A

1-La force ionique (concentration saline)
2-Le pH
3-L’ajout de solvants organiques
4-L’ajout de polymères inertes

41
Q

De quoi dépend la solubilité d’une protéine en solution aqueuse?

A

De la concentration en sels dissous

42
Q

Par quoi est exprimée la concentration en sels?

A

Elle est exprimée par la force ionique I

43
Q

En général, la solubilité d’une protéine varie selon quoi?

A

Selon la nature des ions en solution et augmente avec la concentration de sels en solution

44
Q

Dans quelle zone de force ionique l’augmentation en solubilité avec une concentrations croissante en sels est connue sous le nom de «salting in»?

A

Dans la zone de force ionique de zéro à 0,5 M

45
Q

Que font les sels dans la zone de salting in?

A

Les sels lient directement les protéines et augmentent leur charge nette, ce qui favorise leur solubilité.

46
Q

Dans les concentrations de salting in, les sels lient directement les protéines et augmentent leur charge nette, ce qui favorise leur solubilité. Pourquoi?

A

Parce que les augmentent les interactions avec l’eau et la répulsion entre protéines (moins d’agrégations).

47
Q

La solubilité des protéines de type globulaire décroît avec quoi?

A

Avec la diminution de la concentration de sel

48
Q

La solubilité des protéines de type globulaire décroît avec la diminution de la concentration de sel. Pour quoi cette propriété est utile?

A

Pour dessaler la protéine par dialyse

49
Q

Quel est le désavantage du dessalage de protéine par dialyse?

A

C’est trop long

50
Q

Que peut provoquer la dialyse contre un tampon de faible force ionique? Pour quoi peut-on utiliser ce phénomène?

A

Elle peut provoquer la précipitation des protéines —> peut utiliser ce phénomène pour purifier notre protéine d’intérêt.

51
Q

Quelles est une des techniques les plus utilisées en purification des protéines?

A

Le dessalage ou «salting out» d’une protéine à de hautes concentrations de sel

52
Q

À quoi est dû le phénomène de salting out?

A

Ce phénomène est dû essentiellement à la compétition entre les ions salins ajoutés et les protéines pour la solvatation (accès aux molécules d’eau).

53
Q

L’hydratation des ions de sels a une forte tendance à quoi?

A

À séquestrer les molécules d’eau

54
Q

La séquestration de l’eau résultera en quoi?

A

En une diminution de la solvation des protéines

55
Q

Qu’est-ce qui favorise l’agrégation des protéines?

A

Une fois qu’une quantité suffisante de molécules d’eau a été séquestrée, les protéines auront moins de surface solvatée, ce qui favorisera leur agrégation.

56
Q

Vrai ou faux : Le dessalage est largement une fonction de l’hydrophobicité de la protéine.

A

Vrai

57
Q

Quelles régions de la protéines rendront les protéines à être moins bien solvatées?

A

Les régions hydrophobes

58
Q

Qu’est-ce qui favorise la précipitation des protéines?

A

Une haute concentration de sels

59
Q

Résumé du phénomène de dessalage (salting out)

A

1-Une agrégation protéique qui implique des régions hydrophobes sur la surface d’une protéine

2-Au fur et à mesure que les ions de sels deviennent solvatés, les molécules d’eau libres deviennent peu nombreuse.

3-Il y aura une plus grande tendance pour la protéine de perdre des molécules d’eau autour des résidus hydrophobes (ce qui favorise l’agrégation, puisque les régions hydrophobes exposées ont une préférence à intéragir entre elles plutôt qu’avec de l’eau)

60
Q

La nature du sel est très importante pourquoi?

A

Car les sels qui se lient et interagissent directement avec la protéines peuvent avoir un effet déstabilisant.

61
Q

Comment sont nommés les sels qui ont un un effet déstabilisant?

A

Chaotropiques

62
Q

Que sont les sels optimaux?

A

Ce sont les sels qui encouragent l’hydratation des régions polaires et la déshydratation des régions hydrophobes chez une protéine sans avoir aucune interaction avec la protéine.

63
Q

Comment se nomme la série d’ions qui facilitent la précipitation des protéines?

A

La série Hofmeister

64
Q

Quels sont les ions qui favorisent la précipitation (salting out)?

A

Les anions fortement hydratés et les cations faiblement hydraté.

65
Q

Quels sont les ions qui favorisent la solubilité (salting in)?

A

Les anions faiblement hydraté et les cations fortement hydraté.

66
Q

Quel type d’anions et de cations est préféré? Donner des exemples

A

Des anions multivalents comme le sulfate, le phosphate et le citrate avec des cations comme le potassium, le sodium et l’ammonium

67
Q

Quel est le sel le plus utilisé couramment en précipitation de protéines?

A

Le sulfate d’ammonium : (NH4)2SO4

68
Q

Qu’est-ce que la précipitation différentielle?

A

C’est la précipitation simultanée de plusieurs composés. Quand dépasse la force ionique spécifique à la protéine, cela précipite donc on peut la récupérer (isolation).

69
Q

Résumé du phénomène de salting in + définition

A

Définition : Augmentation de la solubilité d’une protéine dans l’eau par l’ajout de faibles concentrations de sels.

1-Les ions salins interagissent directement avec les protéines

2-Les ions de même charge augmentent la répulsion entre les protéines, ce qui réduit leur agrégation —> favorise leur solubilité

3-Ces ions (qui sont hydrophiles) augmentent les interactions des protéines avec le solvant aqueux —> favorise leur solubilité

70
Q

Résumé du phénomène de salting out + définition

A

Définition : Diminution de la solubilité d’une protéine dans l’eau par l’ajout de hautes concentrations de sels.

1-Les ions salins n’interagissent pas avec les protéines

2-L’ajout de hautes concentrations de sels très hydrophiles amène la séquestration des molécules d’eau par ces ions

3-La quantité de molécules d’eau disponible pour solubiliser les protéines diminue

4-Les régions hydrophobes des protéines seront déshydratées en premier lieu ce qui favorisera le rapprochement des régions hydrophobes des protéines (via des interactions hydrophobes —> effet goutte d’huile)

71
Q

De quoi sont constituées les protéines?

A

Elles sont constituées de nombreux groupes ionisables possédant des pKa différents.

72
Q

Chaque protéine possède un point ou pH isoélectrique. Qu’est-ce que c’est?

A

C’est un point où il y a autant de charges positives que de négatives —> la charge nette de la protéine = 0.

73
Q

Au pH isoélectrique, une protéine à tendance à devenir ________. Pourquoi?

A

-Moins solubles : une protéine avec une charge globale nette près de zéro minimise la répulsion électrostatique et permet aux forces électrostatiques locales de prédominer menant ainsi à une attirance entre les molécules —> agrégation —> précipitation.

74
Q

Comment s’appelle le phénomène de précipitation au pH isoélectrique et qu’est-ce que cela permet?

A

Précipitation isoélectrique : permet de purifier une protéine sélectivement en amènent le pH au point isoélectrique de cette protéine.

75
Q

Qu’est-ce qui arrive quand on ajoute un solvant miscible avec l’eau, comme l’éthanol ou l’acétone, à un mélange contenant des protéines?

A

Cela diminue leur solubilité.

76
Q

Le pouvoir de l’eau de solubiliser une macromolécule chargée _______ avec la concentration du solvant organique dans la solution.

A

Décroît —> réduction de la constante diélectrique de l’eau

77
Q

Qu’est-ce que la constante diélectrique?

A

C’est le pouvoir de solvatation de l’eau pour des ions dissous (comme les protéines).

78
Q

L’agrégation de molécules est provoquée par quoi?

A

Par l’interaction entre des régions possédant des charges opposées.

79
Q

Quel est le facteur qui détermine la solubilité d’une protéine dans un solvant aqueux/organique? Pourquoi?

A

La taille de la protéine : plus grand est la protéine, plus basse est la concentration en solvant organique nécessaire afin de la précipiter. Les protéines plus larges possèdent une surface plus grande, donc une meilleure chance d’avoir une région à la surface chargée qui est complémentaire avec une autre protéine.

80
Q

Comment trouver la meilleure méthode d’isolement de protéines?

A

Il faut regarder les propriétés de la protéine (taille moléculaire, charge ionique, solubilité, spécificité) pour trouver les conditions optimales d’isolement.

BCM 1521 (6 decks)

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