Seminarium frågor Flashcards
Spelar det någon roll om standardlösningen och provlösningen är gjorda med olika lösningsmedel (motivera ert svar!)
Ja det kommer spela roll eftersom en referens och ett okänt prov måste mätas under samma förutsättningar
Vid en analys av paracetamol (se struktur nedan) med UV spektroskopi kan två olika UV spektra erhållas beroende på om substansen löses i en vattenbaserad sur eller basisk lösning. Redogör för varför olika pH i lösningsmedlet resulterar i två olika UV spektra för paracetamol.
Den första viktiga observationen är att substansen är en svag syra pga den aromatiska hydroxidgruppen (kvävet finns i en amid=aprot). Vid höga pH (2 enheter över pKa värdet) kommer substansen vara laddad. Detta innebär ytterligare ett fritt elektronpar som kan stabiliseras vid resonanseffekter. Detta förändrar det konjugerade systemet som kommer påverka spektra för substansen.
Du jobbar som valideringskemist på ett läkemedelsföretag som bland annat syntetiserar paracetamol (se struktur nedan). Du har nu fått två masspektrum (A & B nedan) från olika tillverkningsbatcher av paracetamol skickade till dig för kontroll innan batcherna släpps för försäljning. Masspektrumen är erhållna i full scan (MS1)-mode.
a) Är masspektrumen som du ska tolka erhållna med en hård- eller mjuk joniseringsteknik? Motivera!
b) Vad kan du, utifrån masspektrumen som du erhållit, säga om de två batchernas identitet? Innehåller båda proverna paracetamol? Motivera! Om du drar slutsatsen att ett av proverna inte innehåller paracetamol, resonera utifrån spektrumet kring vad provet istället kan innehålla.
c) Kan du utifrån erhållna spektrum vara säkra på att något av proverna endast innehåller paracetamol? Motivera ditt svar!
A) Spektrumen är erhållna med en hård joniseringsteknik (i detta fall electron impact, EI), vilket kan ses av att en radikal av analyten har bildats, [M]+.. Molekyljonens m/z är alltså densamma som analytens molmassa (151).
B) Batch A innehåller inte paracetamol, då analyten som gett upphov till detta spektrum innehåller klor. Denna slutsats kan dras då topparna vid m/z 151 respektive m/z 153 motsvarar isotopmönstret som klor ger upphov till. Vidare återfinns ett fragment vid m/z 116 i spektrumet, vilket motsvarar en förlust av klor från molekyljonen.
Batch B kan däremot, utifrån informationen som ges i uppgiften, mycket väl innehålla paracetamol baserat på molekyljonens m/z och att fragmenten som återfinns i spektrumet kan förklaras utifrån paracetamols struktur.
C) Här bör referensspektra nämnas. Kompletterande data/experiment som jämförs med referenssubstans (i synnerhet med avseende på retentionsfaktor, men gärna även NMR spektra, IR-spektra, smältpunkt) får även gärna nämnas.
Beskriv kortfattat hur ni skulle kunna identifiera en okänd substans med hjälp av masspektrometri med hård jonisering (electron impact). Tänk på att beskriva det från ett praktiskt perspektiv, vad skulle behövs för att genomföra detta på ett labb?
Molekyler fragmenterar (hård jonisering) enligt förutbestämda regler. Fragmentens vikter (och intensiteter) kan matchas mot en referenssubstans alternativt jämföras med ett bibloteksspektrum.
En vattenlösning innehåller imipramin och acetylsalicylsyra (se nästa sida). Beräkna de betingelser som krävs för att separera de två ämnena fullständigt genom en enkel vätske-vätskeextraktion. Den organiska fasens sammansättning får inte ändras.
Beräkna fasvolymsförhållandet
Kvantitativ extraktion då P ≥ 99
Redogör, med era kunskaper kring vätske-vätske extraktion, för hur valet av organiskt lösningsmedel (”solvent”) påverkar extraktionsgraden för ropivakain och dess två metaboliter (PPX och 3-OH-ropivakain) från en vattenlösning. Fokusera på struktur-fördelningsteori.
Uppgiften berör till stora delar förståelsen för ”lika löser lika” begreppet.
Ropivakain är mest hydrofob samt har ingen protolyserbar funktionell grupp, därefter följer PPX som i jämförelse med Ropivakain saknar en kolkedja (således mer polär), sist kommer 3-OH-ropivakain som har en svagt sur funktionell grupp (OH) som dessutom gör substansen betydligt mycket mer polär än övriga. Heptan är ett organiskt lösningsmedel som inte har varken protonaccepterande eller donerande egenskaper. En blandning av heptan/etylacetat är en mer polär lösning, utöver detta kan etylacetat acceptera protoner (förslagsvis f.a från OH (3-OH-ropivakain) vilket innebär att denna blandning (speciellt med högre andel etylacetat) är fördelaktig om målet är en kvantitativ extraktion av denna metabolit.
Ett kromatografiskt separationssystems förmåga att separera två ämnen brukar anges med ett värde på upplösningen, Rs. Beskriv tre principiellt olika sätt att öka Rs samt redogör kortfattat för innebörden av de tre parametrarna ni beskriver.
Resolutionen = effektiviteten x selektivitetsfaktor x retentionsfaktorn En ökad effektivitet (N) kan fås genom en längre kolonn (H=L/N) eller/och mindre partikelstorlek. Selektiviteten kan påverkas av valet av organisk modifierare, retentionen kan påverkas av halten organisk modifierare samt pH i mobilfasen för protolyserbara analyter. Mobilfasflödet har också betydelse via van Deemters ekvation (se senare fråga). Praktiska exempel på detta gavs under sista separationsföreläsningen.
Du har fått i uppgift att separera tre olika smärtstillande substanser: ibuprofen, naproxen och paracetamol. Det kromatografiska systemet som finns tillgängligt är ett LC-system med en C18 stationärfas och en mobilfas bestående av fosfatbuffert (pH 3,0) och metanol (70:30).
a) Resonera dig fram till en möjlig retentionsordning för dessa substanser.
b) Hur påverkar andelen metanol samt valet av pH i mobilfasen retentionen? Motivera!
A Vid pH 3.0 kommer paracetamol (svag syra) vara fullständigt (99%) oladdad, vilket skapar stora möjligheter till stark interaktion med den opolära stationärfasen (C18). Det är sannolikt att laddningsgraden här kommer påverka starkt, e.g paracetamol kommer eluera sist ur kolonnen (ha högst retention). Ibuprofen och Naproxen är också svaga syror (karboxylsyror) med liknande pKa värden. Vid pH 3 kommer dessa att vara delvis laddade, skillnaden i laddningsgrad räcker inte för att motivera en retentionsordning. Vi kan dock se viss skillnade i log P värde, ett högt log P innebär en hydrofob substans. Ibuprofen är således mer hydrofob än naproxen, dock har naproxen två aromatiska (och plana) ringar som i stor utsträckning kan skapa van der Waal interaktioner till C18 kolonnen. Det är svårt att avgöra vilka av dessa egenskaper som dominerar, dock är det mer sannolikt att retentionsordningen blir naproxen-ibuprofen-paracetamol (baserat på log P). B En ökad andel organiskt modiferare (MeOH) kommer innebära en minskad retention för samtliga analyter med opolär karaktär. En förändring av pH som resulterar i en ökad laddning hos analyter kommer innebära en minskad retention. Omvänt gäller också.
Vid en LC-analys erhålls en retentionstid på 8,9 (substans A) respektive
12,5 (substans B) minuter för två aktiva substanser. Tiden för en
oretarderad substans är 1,60 minuter på detta LC-system. Basvidden för
A = 1,0 min och B = 1,5 min.
a) Beräkna selektivitetsfaktorn mellan ämne A och B
b) Beräkna effektiviteten för topparna
c) Bedömer ni att resolutionen är tillräckligt bra? Motivera!
-
Du står inför valet av separationsteknik inför en kommande analys. Följande förutsättningar gäller: provet är en komplex blandning av flera substanser samt att du har tillgång till en mycket begränsad provvolym (dock i hög koncentration). Vilken/vilka separationsteknik(er) vore ett lämpligt val? Motivera!
Vad som är känt är följande: en komplex blandning av många analyter (ställer höga krav på effektiviteten (N) hos separationssystemet) samt låg provvolym (behöver kunna injicera en låg volym) i kombination med höga koncentrationer.
CE (låg provvolym [nL] samt vill ha höga koncentrationer);
GC (hög effektivitet pga lång kolonn, injektionsvolym [uL], men analyterna måste vara termostabila och flyktiga derivatisering är möjligt);
LC (injektion kring 10 uL, stora möjligheter till effektiv separation mha förändringar av mobilfassammansättning).
Du injicerar 20 mikroliter av en provlösning vars koncentrationer av tolbutamid är 4,5 10-5 M. Koncentrationen av tolbutamid i provzonen som lämnar kolonnen är 1,8 10-6 M. Vad är orsaken till koncentrationsminskningen?
Vi kan inte ”bli av med” substans inne i kolonnen, dock kan provzonen (området där analytmolekylerna rör sig) att spädas ut under analysen (=bandbreddning). Detta innefattar Eddy diffusion (A), longitunell diffusion (B) samt långsamma jämviktsinställningar mellan analyt-statfas-mobilfas (C). Eftersom färre molekyler når detektion under en given tidsperiod (bandbreddning) kan vi ha problem med att vi ligger under LOD eller LOQ, alternativt kan integreringen av signalen bli ett problem. Detta innebär att vi detekterar en lägre koncentration än den faktiska koncentrationen. Svaren bör också innehålla en kortare beskrivning av vad termerna A, B och C innebär samt kopplingen till van Deemter (och H i relation till N).
