Seminarai Flashcards
Baltymų evoliucija in vitro
Baltymų molekulinę evoliuciją sudaro pagrindiniai du etapai: diversifikacija ir selekcija. Molekulių diversifikacija yra įvairių mutacijų pritaikymas (taškinės mutacijos, delecijos, elongacijos, rekombinacijos) baltymus koduojančiuose genuose
Ląstelėms natūraliai būdingas ryšys tarp genotipo ir fenotipo, kadangi genai yra membranos viduje, todėl ląstelės yra plačiai naudojamos baltymų evoliucijai. Jos gali kurti mutantinius baltymus transformuodamos genų bibliotekas.
Pagrindiniai etapai:
- DNR maišymas;
- aukšo pralaidumo atranka;
- fizinis atskyrimas;
- RNR-peptido ryšys
Baltymų evoliucijos metodai:
- cell-surface display ;
- phage display (dažniausiai naudojamas norint atrinkti baltymą pagal jungimąsi);
- in vitro transliacija;
- mRNR display (plačiausiai naudojamas metodas tiriant baltymų jungimąsi)
- ribosome display;
- in vitro kompartmentalizacija;
Genų diversifikacijos metodai:
- Atsitiktinio pakeitimo mutagenezė;
-DNR maišymas;
- laipsniškas pratęsimo procesas;
- atsitiktinė chimerogenezė trumpalaikiuose šablonuose;
- laipsniškas sutumpinimas hibridiniam fermentui sukurti;
- atsitiktinė elongacijos mutagenezė
Fermentų evoliucijos in vitro nauda:
- fermentui nereikia kirsti ląstelės sienelių, kad pasiektų substratą;
- gali būti naudojami ląstelei toksiški substratai ir fermentai;
- galima tirti in vitro sukurtus fermentus, kurie yra stabilesni ekstremaliomis pH, temperatūros ir jonų koncentracijos sąlygomis, esant denatūrantams ar organiniams tirpikliams;
- leidžia tiksliau atvaizduoti fermentų veikimą
lncRNR
Daugiau nei 200 nt turinčios RNR sekos;
Pagal lokaciją skirstomos:
- tarpgenines;
- intronines;
- sensorines;
- antisensorines
lncRNR tiesiogiai jungiasi su DNR transkripcijos metu ir formuoja R kilpas sudarydamos RNR-DNR hibridą;
lncRNR reguliuoja epigenetines modifikacijas branduolyje, reguliuoja genų transkripciją, transkripcijos lygyje moduliuodamos histono arba DNR modifikaciją, metilinant bei acetilinant;
lcnRNR panaudojimas:
- vėžinių susirgimų gydyme, diagnozavime;
- širdies ligų gydyme, diagnozvime;
- susiję su neuropatologijomis:
AD, ALS, šizofrenija, kt.
Mikrogardelių pritaikymas
DNR mikrogardelės yra stikliukai, kuriuose yra maži šulinėliai, į kuriuos dedamos DNR seka, kuri veikia kaip zondas. Jis naudojamas aptikti tūkstančių skirtingų genų ekspresiją tuo pačiu metu.
Mikrogardelių rūšys:
- DNR;
- baltymų;
- peptidų;
- cheminių junginių;
- Mmchips skirtos miRNR stebėjimui;
- audinių;
- ląstelių;
- antikūnių;
Taikymo pvz.:
- ligų diagnozė;
- mikrobų aptikimas ir identifikavimas;
- imunologija;
- nustatyti giminės ryšius;
- kriminalistikoje
Genetinio kodo išplėtimas
Pagrindiniai skirtumas - dirbtinai pakeistas genetinis kodas, kuriame bent vienas kodonas koduoja nestandartinę aminorūgštį (nsAAs);
Genetinį kodą išplėsti galima:
- keli kodonai koduoją tą pačią aminorūgštį;
- galima pakeisti, kad nuskaitytų ne kodoną, o kvadrupletą
Kam to reikia:
- įtraukus nsAAs - naujos galimybės išplėsti baltymų ir peptidų sintezę, funkcijas, pvz.: fluoroscencija, jungtų ligandus, cross-linking;
Norint išplėsti genetinį kodą reikia:
- modifikuoti ribosomas;
- įvesti susintetintas ar iš kitų organizmų gautas amino rūgštis;
- modifikuoti transkriptą: pakeisti, kad kodonas koduotų nestandartinę aminorūgštį;
- modifikuoti tRNR;
Genetinio kodo plėtimas modeliniuose organizmuose:
- baltymų funkcijų ir struktūrų tyrimams
Modeliniai organizmai:
- Caenorhabditis elegans (nematodas);
- Drosophila melanogaster (vaisinė muselė);
- Danio rerio (zebražuvių embrionuose);
- Mus musculus (pelėse)
Privalumai:
- įvairios modifikacijos;
- daugybinių pakitimų įvedimo galimybė;
- tinkamas daugeliui baltymų;
- tinka tyrimams skirtingomis (kintančiomis) sąlygomis;
- minimaliai lemia baltymų struktūrą;
- tinka pritaikymas terapijoje, vakcinų kūrime;
Trūkumai:
- reikalavimai įterpiamiems junginiams;
- natūralios baltymos struktūros ir funkcijos tikdymas
Onkogenai ir vėžio supresoriai
Onkogenai - genai, kurių mutacijos ar epigenetiniai pokyčiai nulemia normalių eukariotinių ląstelių virtimą piktybinėmis;
Susidaro mutuojant proto-onkogenams;
Onkogenų kategorijos/funkcijos:
- augimo faktoriai;
- augimo faktroiaus receptoriai;
- signalo keitikliai;
- transkripcijos faktoriai;
- užprogramuotos mirties reguliacija
Pavyzdžiai:
- Ras; - HER2;
- Myc; - Ciklinas D;
Vėžio supresorius - koduoja baltymą, kuris reguliuoja ląstelių dalijimąsi ir palaiko jį kontroliuojant.
Supresorių kategoijos/funkcijos:
- genai, kontroliuojantys tam tikros ląstelės ciklo stadijos progresavimą;
- genai, slopinantys ląstelės replikaciją;
- genai, kurie sustabdo ląstelių ciklą, reaguodami į DNR pažeidimą;
- genai, signalizuojantys apie ląstelės savaiminį sunaikinimą;
- genai, ištaisantys DNR klaidas;
Pavyzdžiai:
- PARP; - p53;
Vėžio supresorių manipuliacija pagrįsta priešvėžine terapija:
- panaudojant virusinę genų terapiją, įterpiamas vėžio supresoriaus genas;
- nevirusinės genų terapijos metu genetinė informacija perduodama cheminiu būdu
Transgeniniai organizmų kūrimas
Transgeniniai organizmai/genetiškai modifikuoti organizmai - organizmai savyje turintys svetimą DNR, įvestą dirbtinai/biotechnologiniais metodais
Pagr. etapai:
- geno identifikavimas;
- geno perkėlimas į ktią organizmą;
- geno ekspresija/organizmų su pasireiškusia geno veikla atrinkimas;
Pagr. metodai:
- plazmidės metodas;
- DNR mikroinjekcija;
- genų perkėlimas naudojant embrioninių kamieninių ląstelių liniją;
- genų perkėlimas pasitelkiant retro/lenti-virusinius vektorius;
TO/GMO panaudojimas:
- žemės ūkyje: kenkėjams atsparių pasėlių sukūrimas;
- medicinoje: aiškiau suprasti ligų mechanizmus, sukūriant organizmus sergančius tomis ligomis;
- pramonėje: voratinklių šilko gamyba ožkos piene, mielėse
Etinės problemos:
Gyvūnų manipuliacija žmogaus naudai;
Požiūris į gyvūnus kaip į daiktą, o ne kaip į gyvą sutvėrimą
Transkripcijos veiksnių aktyvacijos tyrimo metodai
EMSA - elektroforezinis mobilumo poslinkio tyrimas, dar vadinamas gel shift assay
- tiria ar dominantinis baltymas jungiasi prie DNR;
- remiasi tuo ar DNR seka judės elektroforėzės geliu greičiau nei DNR seka susijungusi su baltymu;
- autoradiogramoje matomas radioaktyviai pažymėtos DNR poslinkis gelyje;
Su antikūniais:
- Western-Blot: elektroforėzė -> baltymai užnešami į baltymus surišančią membraną;
- ELISA - su fermentais susietas imunosorbentinis tyrimas, organiškai sujungia imunines reakcijas tarp antigenų ir antikūnių su fermentų katalize;
ChiP: ląsteles suardo, išskiria DNR -> antikūniai padeda atsirinkti kas domina -> analizuojami/sekvenuojami/PGR
DamID in vivo:
- transgeninės Dam ekspresuojančios ląstelės;
- adenino metiltransferazė (Dam) (Dam metilina adeninus GATC sekose)
- metilinimui jautri endonukleazė Dpnl -> PGR
Transkripcijos faktorių aktyvinimo tyrimai:
gali būti naudojami norint nustatyti mutacijų ar farmacinių junginių poveikį signalo aktyvavimui.
Konkretūs transkripcijos veiksniai dažnai yra labai svarbūs inicijuojant genų ekspresijos modelius, dėl kurių atsiranda didelių vystymosi pokyčių.
Dažnai yra paremti antigeno-antikūnio sąveika
