Semaine 4 Flashcards
Méthodes de culture-indépendante
Qu’est-ce que l’ADN représente? (3)
- Les MO viables, morts et non-cultivables
Qu’est-ce que l’ARN représente? (1)
Les gènes transcrits (MO vivants)
L’ADN fournit des renseignements sur quoi? (2)
- La diversité microbienne dans l’échantillon (nombre de M0)
- La présence/absence des gènes d’intérêts
L’ARN fournit des renseignements sur quoi? (2)
- Expression génétique de la communauté
2. Activité métabolique de la communauté (ARNm qui code pour un enzyme qui effectue l’activité métabolique à l’étude)
Nommer les 3 grandes étapes lorsque l’on travaille avec l’ARN.
- Préservation de l’échantillon
- Isoler l’ARN
- Analyse
Nommer les objectifs de l’isolation de l’ARN? (3)
- Quantité
- Intégrité
- Pureté
Nommer les 3 grandes étapes de l’isolation de l’ARN?
- Lyse des MO
- Purification
- Évaluation
Comment évaluer la pureté de l’ARN?
Spectrophotomètre : ratio 260nm/280nm (>2)
Comment évaluer la quantité de l’ARN?
Spectrophotomètre (1.0 = 40 ug/ml)
Comment évaluer l’intégrité de l’ARN?
Migration sur gel d’agarose
Pour quelles raison on fait l’analyse de l’ARN par PCR avec la transcriptase inverse? (2)
- Pour la détection d’un ARNm spécifique
2. Pour évaluer la présence ou l’absence d’une activité microbienne
Nommer les grandes étapes de l’analyse de l’ARN par PCR avec la transcriptase inverse.
- Hybridation de l’ARN (transcriptase inverse)
- Formation d’un ADNc (complexe ARN/ADN)
- Dénaturation
- Formation d’un brin complémentaire à l’ADNc (ADN polymérase)
But du qPCR?
Quantification du nombre de molécules d’ARNm ou d’ADN d’intérêt présentes dans l’échantillon de départ.
Nommer une technique utilisée pour le qPCR.
SYBR green
Comment fonctionne le SYBR green?
Fluorescence : lorsqu’il y a interaction entre les molécules du SYBR green et les doubles brins d’ADN
Définir le cycle seuil.
Le nombre de cycle qui correspond à un nombre de copies qui est suffisamment élevés pour permettre l’intéraction avec le SYBR green.
Nommer les buts du séquençage d’ARNm (transcriptomique). (2)
- Identité des ARNm présents dans l’environnement
2. Abondance des ARNm présents dans l’environnement
Le qPCR permet d’examiner combien de gènes en même temps?
1
La transcriptomique permet d’examiner combien de gènes en même temps?
Plusieurs
Le qPCR et la transcriptomique sont utilisées dans un contexte de culture dépendant ou indépendant?
Indépendant
Nommer les buts de la microscopie optique. (3)
Évaluation sommaire de :
- diversité bactérienne
- structure
- Dénombrement direct des MO
Nommer les types de microscopie optique. (4)
- Fond clair sans colorant
- Fond clair avec colorant
- Contraste de phase
- Interférentielle ou DIC
Nommer les caractéristiques de la microscopie à contraste de phase. (2)
- Spécimens vivants non colorés
2. Apparaissent contrastés sur fond gris
Nommer les caractéristiques de la microscopie interférentielle ou DIC. (2)
- Spécimens vivants non colorés
2. Apparaissent contrastés en trois dimensions
Nommer deux inconvénients de la microscopie optique.
- Bruit de fond
2. Pas de distinction de la viabilité
Qu’utilise-t-on pour distinguer les MO en microscopie à fluorescence? (2)
- Colorants
2. Anticorps fluorescents
Est-il possible d’évaluer la viabilité des MO avec la microscopie à fluorescence?
Oui
Nommer les deux types de colorants.
- Colorant non-spécifique (DAPI)
2. Colorant de viabilité
Avec la microscopie à fluorescence il est possible d’examiner comment les MO interagissent entre eux et avec leur environnement. Par conséquent, les sondes spécifiques (fluorophores) sont utilisées pour cibler quelles séquences?
ARN 16s
Lorsque l’on parle de sondes fluorescentes on fait référence à?
Amorces couplées à un fluorophore
La microscopie optique et à fluorescence sont des techniques de culture indépendantes ou dépendantes?
Indépendantes, sauf pour les bio-rapporteurs
Pourquoi utiliser des bio-rapporteurs en microscopie à fluorescence?
Pour être capable de détecter des gènes dont leur expression est difficile à détecter avec des gènes dont l’expression est facilement détectable.
Nommer un exemple de rapporteur?
Protéines fluorescentes (GFP)
Nommer les deux types de fusion lors de l’utilisation des bio-rapporteurs?
- Fusion transcriptionnelle
2. Fusion traductionnelle
Définir le fusion transcriptionnelle.
Fusion des gènes intervenant dans la région transcrite et non traduite.
Définir le fusion traductionnelle.
Fusion des gènes effectuées dans leur partie codante.
Nommer les deux types de microscopie électronique.
- à transmission (TEM)
1. à balayage
Quelle est la différence entre la microscopie électronique à transmission et à balayage.
à transmission : couche mince, utilisation de plusieurs images pour former du 3D
à balayage : 3D
Que peut-on faire avec la cytométrie en flux? (2)
- Trier les cellules
2. Quantifier les populations
Quels sont les paramètres mesurés en cytométrie en flux? (2)
FSC : Grandeur
SSC : Granulosité
Comment sont détectées les cellules en cytométrie en flux? (3)
- Fluorescence intrinsèque
- Colorant
- Reporteur fluorescent
Quel est le but de la détermination de la biomasse?
Mesurer la masse totale de MO dans un échantillon.
Quelles techniques sont utilisées pour permettre une détermination de la biomasse directe?
- Utilisation du microscope
2. Fumigation au chloroforme et extraction du carbone
Quel est la technique utilisée pour permettre la détermination de la biomasse indirecte?
Fumigation au chloroforme et incubation
Quelle est la différence entre la méthode direct et indirect pour la détermination de la biomasse?
- Un MO transforme le carbone libre (à l’extérieur de la cellule) en CO2.
- Quantification du CO2 produit
Quelle méthode permet d’évaluer l’activité/taux de doublement (croissance) microbien en général?
Utilisation isotope radioactif
Quelle est la méthode utilisée pour déterminer quels MO composent une communauté donnée?
Biomarqueurs lipidiques
Quels sont les lipides caractérisés pour permettre d’inventorier les MO?
Lipides polaires intacts
Pourquoi les lipides polaires intacts sont utilisés pour inventorier les MO? (2)
- Stables
2. Spécifiques à chaque type de MO
Quels sont les buts de la mesure d’activités microbiennes spécifiques?
- Quantifier une activité métabolique dans une communauté microbienne.
- Évaluer la fonction de la communauté et les changements qu’elle apporte à son environnement.
- Évaluer la réponse métabolique à une perturbation environnementale.
Nommer des exemples de mesures d’activités microbiennes spécifiques. (3)
- Utilisation de microélectrodes
- Quantification directe de processus chimiques spécifiques
- Utilisation de radioisotopes
Quel est l’objectif de l’utilisation de microélectrodes?
Mesure basale de la respiration (CO2) présente dans l’échantillon utilisant les substrats organiques présents (O2).
Nommer un avantage des microélectrodes?
Mesure de l’échantillon directe et sur place
Nommer un désavantage des microélectrodes?
Limité par la technologie disponible.
Nommer des exemples de quantification directe de processus chimiques spécifiques. (4)
- Méthanogenèse
- Dénitrification
- Fixation d’azote
- Réduction du souffre
Nommer un avantage de la quantification directe de processus chimiques spécifiques?
Parfois déjà optimisé
Nommer un inconvénient de la quantification directe de processus chimiques spécifiques?
Plus ou moins sensible
Quel est le principe de l’utilisation des radioisotopes?
Utiliser un radioisotope pour marquer une molécule dont on veut suivre l’utilisation par les MO.
Nommer un avantage de l’utilisation des radioisotopes.
Très sensible
Nommer un inconvénient de l’utilisation des radioisotopes.
Le taux métabolique peut être surestimé.
Nommer les buts de la spectrométrie de masse?
- Quantifier une molécule spécifique
2. Identifier la localisation de certaines molécules dans un environnement donné.
Avant d’effectuer la spectrométrie de masse, les molécules d’intérêts doivent être récupérées par?
Chromatographie (gazeuse, liquide)
Avant de se rendre au séparateur de masse, le matériel est?
Ionisé
Avant de se rendre au détecteur, les ions sont?
Séparés
Que comprend un spectromètre de masse de type MALDI TOF?
- Utilisation d’un laser (ionisation)
2. Détecteur de type : temps de vol (selon la grosseur)
Avec le temps de vol le signal obtenu est exprimé sous quelle forme?
m/z (masse/ion)
Qu’est-ce qui permet la localisation de certaines molécules dans un environnement donné?
La fragmentation
Les méthodes de culture indépendantes sont basées sur quoi? (3)
- Les acides nucléiques
- La microscopie
- Le métabolisme
