Section 5 Flashcards
- Quels sont les 3 principales étapes de l’isolation de l’ADN ou de l’ARN?
- Lyser
- Extraire et purifier
- Concentrer
Que retrouve-t-on dans un tampon chaotropique? Quel est la fonction de chacun de ces constituants?
Tampon chaotropique = tampon de lyse: Lyser les tissus ou les cellules pour l’ADN ou l’ARN
Détergent SDS = solubiliser les membranes
Protéinase K = digère les protéines
EDTA = Agent chélateur des ions divalents (séquestre Magnésium)
Guanidine-HCl / GITC = Dénature les proéines
Béta-mercaptoéthanol = empêche formation des ponts disulfures
- Comment puis-je quantifier de l’ADN ou de l’ARN?
Par l’ABSORBANCE, représentée par les unités de densité optique (D.O.)
Note: la concentration est proportionnelle à l’absorbance
À quelle longueur d’onde s’effectue une lecture pour estimer la concentration d’acides nucléiques dans un échantillon?
260 nm ; soit la longueur d’onde à laquelle ont obtient un absorbance maximale pour les acides nucléiques.
Lors de la quantification d’acides nucléiques, qu’est-ce que le ratio 260/280 signifie?
Le ratio 260/280 (Ratio = DO 260 nm / DO 280 nm) indique la pureté de l’échantillon d’ADN ou d’ARN
Note: la D.O. de 280 nm est la longueur d’onde à laquelle les a.a. composant les protéines ont leur absorbance maximale.
- Quelle est la mesure à prendre pour vérifier la qualité (ou l’intégrité) de l’ARN suite à son isolation à partir de l’extraction d’un tissu ?
Ratio 260/280 doit être plus grand ou égal a 1.6
Définir le principe de l’électrophorèse.
Séparer les molécules en fonction de leur taille et de leur charge en les faisant migrer sur un gel où on applique du courant
Pourquoi fait-on varier la porosité des gels d’électrophorèse utilisés lors de l’analyse des échantillons d’ADN ou d’ARN?
Lors de l’analyse des échantillons d’ADN ou d’ARN on fait migrer dans le gel les molécules d’ADN ou d’ARN chargées négativement (par la présence de gr. phosphates) vers l’anode positive. Lors de la migration, les molécules passent à travers de pores (mailles) d’un gel ou elles se séparent selon leur taille. Les grosses molécules sont davantages retardées, elles migrent moins vite que les petites molécules qui ont plus de facilité à passer au travers des pores. On fait varier la porosité des gels d’électrophorèse utilisés selon la taille des fragments que l’on fait miger.
- L’agarose a un faible pouvoir de séparation et est utilisé pour les grands fragments.
- L’acrylamide (très petites pores) a un pouvoir de séparation élevé et est utilisé pour la séparation de petits fragments.
Quel est le rôle du bromure d’éthidium
Quel est le rôle du bromure d’éthidium = agent intercalant = visualisation?
Pour visualiser les fragments d’ADN après l’électrophorèse, on trempe le gel dans une solution contenant du bromure d’éthidium. Il s’intercale entre les acides nucléiques et possède la propriété de fluorescer en rouge orange lorsque excité sous une lumière UV. Seulement le Bromure intercalé entre les acides nucléique devient fluorescent.
Qu’est-ce qu’une sonde (probe) et quelle est l’utilité d’une sonde d’acide nucléique?
Les sondes nucléiques sont des fragments d’acide nucléique qu’on utilise, lors de réaction d’hydratation, pour repérer les fragments d’acide nucléique complémentaire auxquels on s’intéresse.
- Sur quelle base les sondes nucléotidiques fonctionnent-elles?
La sonde nucléique est complémentaire et antiparallèle au segment d’acide nucléique à reconnaître. Elle va couvrir l’ensemble ou une partie du segment d’acide nucléique et détecter sa copie complémentaire. Elle est repérable par radioactivité ou encore par coloration-fluorescence.
Quels sont les 2 paramètres physiques les plus importants qui définissent la réaction d’hybridation entres une sonde et sa cible (les deux étant composés d’ADN)?
- Longueur de la sonde (proportionnelle à la spécificité)
2. Perfection de la complémentarité (pour hybridation + stable)
- Définir ce que l’on entend par une analyse Southern.
Analyse Southern = procédure de transfert des fragments d’ADN séparés, par leur migration sur le gel, à une membrane pour produire une réplique précise de la répartition des molécules dans le gel. L’objectif est de permettre aux fragments de devenir accessibles à une sonde lors de l’hybridation.
- Définir le principe de la détection par autoradiographie, par colorimétrie ou par fluorescence.
Pour détecter où se fixent les sondes
Autoradiographie = Lorsque les sondes radioactives sont détectées à l’aide d’émulsion à l’argent
Les molécules d’ADN qui auront hybridés une sonde ou qui seront marqué radio activement pourront être détecter directement
Colorimétrie = transformation de substrat incolore en précipité de couleur violacée par la phosphatase alcaline ce qui indiquera la localisation de l’hybridation
Fluorescence = l’anticorps sera marqué à la fluorescence
- Définir ce que signifie hybridation in situ, pourquoi utilise-t-on cette technique ?
Hybridation in situ = déterminer sur des coupes histo les cellules d’un tissu accumulant une population donnée d’ARNm. DONC permet de détecter les ARNm dans un tissu.
