Section 4 Flashcards
Définir bout cohésif vs bout franc.
Palindrome = sites de restriction = séquence de nucléotides reconnue par les enzymes de restrictions; il s’agit de séquences d’ADN à symétrie inversée ou la séquence de nucléotides est la même pour le brin I lu de 5’ vers 3’ que pour le brin II lu également de 5’ vers 3’
Enzyme de restrictions = outils de provenance bactérienne pour couper l’ADN ex: HindIII
Bout cohésif = coupure de l’ADN
Bout franc = coupure de l’ADN au milieu du palindrome
- Définir isoschizomère.
Enzymes de restrictions qui proviennent de souches bactériennes différentes, donc portent de différents noms, MAIS coupent l’ADN au MÊMES sites de restriction.
Qu’est-ce que l’on entend par enzymes de restriction compatible?
Enzymes de restriction qui ne reconnaissent pas le même site de restriction, MAIS génère des fragments aux extrémités cohésives complémentaires qui peuvent être réunis.
- Quelle est la fonction de ces enzymes : DNase, RNase, ligase, phosphatase, ADN polymérase, reverse transcriptase?
- DNase = endonucléase qui peut couper l’ADN double brin au hasard utilisée pour se débarrasser les molécules d’ADN qui contaminent les préparations d’ARN ou de protéines
- RNase = enzyme qui possède une activité exo et endonucléase et détruisent l’ARN sans aucune spécificité – utilisée pour se débarrasser les molécules d’ARN qui contaminent les préparations d’ADN
- Ligase = lie 2 fragments d’ADN
- Phosphatase = élimination de groupements phosphates en 5’ d’un fragment d’ADN – utilisé lors de l’insertion de fragments pour empêcher le vecteur de se refermer sur lui même avant l’insertion
- ADN polymérase = synthétise de l’ADN; nécessite une amorce pour débuter la synthèse; activité polymérase 5’ vers 3’ et exonucléase (relecture) 3’ vers 5’
- Reverse transcriptase = fabrique un ADN complémentaire à partir d’un ARN messager
- Que signifie le terme vecteur en biologie moléculaire?
Vecteur = ADNs dans lesquels nous insérons un fragment d’ADN à étudier.
Ex: Plasmide qui est un ADN bactérien circulaire dans lequel on peut insérer un gène. Les bactériophages sont des virus de bactéries
- Pourquoi différents vecteurs sont utilisés en biologie moléculaire?
ADN recombinant = vecteur + ADN étranger à insérer
Les vecteurs possèdent dans leur génome les signaux nécessaire à leur réplication, et donc peuvent se multiplier une fois introduits dans les cellules-hôtes (bactéries).
Utilisation des plasmides: clonage des fragments d’ADN à étudier ou pour générer une construction d’ADN recombinant qui permet qui permet l’expression de la protéine exprimée par un gène particulier
Utilisation des bactériophages: vecteurs de clonage de fragments d’ADN
- Expliquer ce qu’on entend par le “cycle lytique” du phage lambda
Le cycle lytique est un mode de multiplication ou le phage se multiplie dans la bactérie, et les nouveaux phages formés sortent en lysant (détruisant) cette bactérie.
Étapes:
1.Absorption et pénétration (récepteurs protéiques de maltose)
2.Injection de l’ADN dans la cellule hôte *Cette ADN ne sera PAS INTÉGRÉ dans l’ADN bactérien, mais restera dans le cytoplasme
3.Multiplication du phage
4.Libération des phages par la lyse de la bactérie
- Nommez 2 types de phages utilisés au labo?
Phages lambda
Phages M13
- Lors de la réplication (multiplication) des phages, expliquez 2 façons mentionnées au cours et labos par lesquelles les phages peuvent infecter les bactéries et nommez 2 façons dont les phages peuvent sortir de la bactérie.
Phages lambda:
Entrée par récepteurs (utilisés normalement pour transporter le maltose)
Sortie par lyse bactérienne
Phages M13:
Entrée par pilus secuels F de E. coli
Sortie par bourgeonnement- Sur un plasmide ou phagémide que signifie la région “Ori”, quelle est sa fonction?
Région Ori = Origine de réplication : Permet la réplication du plasmide, indépendamment de la bactérie pour produire un grand nombre de copies.
Note: les Ori on étés mutés afins que les plasmides puissent se répliquer indépendamment des bactéries; pour en faire un outils de clonage au labo et ainsi contrôler nous-même le nombre de copies. Avant-cela, le nombre de copies du plasmides était contrôlé par une protéine bactérienne.
Sur un phagémide que signifie la région “f1”, quelle est sa fonction?
Phagemide = vecteur artificiel hybride combinant les avantages des phages M13 et des plasmides F1 = s.quence qui permet l’initiation de la réplication
- Quel est le rôle du site de clonage multiple dans un vecteur?
Fragment d’ADN ou on retrouve tout un choix de site de restriction (=palindrome) unique, c-à-d. des sites de restriction qu’on ne retrouve pas ailleur dans le vecteur. Il faut une variété de sites de restriction pour matcher les différents fragments d’ADN insérés dans le vecteur.
- Pourquoi a-t-on positionné le site de clonage multiple dans la sous-unité alpha de la beta-galactosidase?
la B-Gal agit comme rapporteur en donnant une couleur à la bactérie
S’il n’y a pas de fragment d’ADN étranger introduit dans le plasmide, la B-Galac sera produite et la bactérie sera colorée.
Si un fragment est introduit dans le plasmide, la B-Gal va etre étruite et les bactérie de seront incolorée
L’insertion des sites de restriction n’affecte pas la B-Gal mais l’insertion d’ADN étranger annule la production de la B-Gal
C’est donc une facon de voir si le plasmide à bien intégré l’ADN
- Comment peut-on estimer le nombre de bactéries dans un bouillon de culture?
Par l’équation de la densité optique (DO) ??
- Expliquer ce qui se passe lorsque vous ensemencez un bouillon de culture bactérienne à l’aide d’une colonie de bactéries? (En d’autre mots définir dans le temps la croissance bactérienne en fonction de la densité optique, quels sont les phases rencontrées?)
1.Phase latente: bactéries synthétisent des enzymes pour dégrader les nutriments présents dans le bouillon (pour se nourrir et croitre)
2.Phase exponentielle: des protéines bactériennes produites suite à l’absorption des nutriments permettant la croissance le nb de bactéries double touts les 20minutes **MOMENT OPTIMALE POUR L’INFECTION
3.Phase stationnaire: il n’y a plus assez de substrats (nutriments) et d’oxygène pour la croissance… donc croissance = mort
4. Phase de mort cellulaire: nb de bactéries décroît car +de morts que de croissance
La vitesse de croissance d’une culture est appréciée en mesurant la densité
optique
