PCR

Question 1

• Nommez et expliquez les différentes étapes essentielles à un cycle de PCR.

Answer 1

1. Dénaturation = séparation des brins
2. Hybridation = fixation d’amorce
3. Élongation de nouveaux brins complémentaires

Question 2

Nommez 2 caractéristiques que possède l’ADN polymérase utilisée dans la réaction de PCR

Answer 2

1.Résistante à la dénaturation
2.Capacité de soutenir des températures de 95 à 100 degrés
DONC on utilise la TAQ DNA POLYMÉRASE dans la réaction de PCR

Question 3

• Nommez au moins 3 paramètres qui définissent le choix des amorces utilisées dans la réaction de PCR.

Answer 3

1. Longueur entre 18 a 24 nucléotides
2. Éviter les répétitions triples de la même base
3. Éviter la formation de loupes ou de structures secondaire dans l’amorce

Question 4

À quoi sert le hot start (5 min à 95 degré) au début d’un PCR?

Answer 4

Pour séparer les 2 brins d’ADN

Question 5

Qu’arrivera-t-il si les amorces ont des séquences complémentaires?

Answer 5

Les amorces risques de s’hybrider l’une à l’autre… À ÉVITER

Question 6

Pour quelles raisons l’amplification par PCR atteint un plateau après un certain nombre de cycles?

Answer 6

??

Question 7

Quels sont les avantages d’utiliser la PCR?

Answer 7

PCR (Polymérisation en chaîne) =  d’amplification de gènes, c-à-d pour créer rapidement plusieurs copies d’un gène. 
Technique rapide 
Rentable
Synthèse chimique In vitro ??
Applications variées

Question 8

• Quels sont les désavantages d’utiliser la PCR?

Answer 8

?

Question 9

• Peut-on évaluer la quantité d’un ARNm lorsque l’on regarde le produit amplifié par PCR (après 40 cycles)?

Answer 9

Non, car la PCR est une technique d’amplification propre à l’ADN

Question 10

• Quelle technique puis-je utiliser afin de remédier à cette situation

Answer 10

RT-PCR (Reverse Transcriptase suivit d’une amplification par PCR) = extraire les ARN totaux et transformer in vintro les ARNm en ADNc simple brin grace à la reverse transcriptase, puis procéder la PCR

Question 11

Quels sont les deux avantages principaux du qPCR par rapport au PCR traditionnel?

Answer 11

Ajout d’un agent intercalant ce qui nous permet de voir a chaque cycle ce qui se passe.

Permet de quantifier pour comparer 2 différentes populations de cellules

Question 12

Quelle molécule permet de suivre l’amplification à chaque cycle d’un qPCR

Answer 12

Agent intercalant (ex: fluorescent) permet l’amplification à chaque cycle d’un qPCR

Question 13

Pourquoi effectuer une courbe standard pour chaque paire d’amorces utilisée en qPCR?

Answer 13

Pour visualiser le seuil d’efficacité

Question 14

Dans la technique de qPCR (PCR quantitatif, PCR en temps réel) à quoi sert la courbe de dissociation (melting curve)?

Answer 14

?

Question 15

Lorsque la melting curve est effectuée à la fin d’une réaction de qPCR. Je m’attends à voir combien de pics? Que signifie l’apparition d’un pic à une très faible température?

Answer 15

1 seul pic visible = 1 amplification du produit d’intérêt

???

Question 16

Quel est l’utilité de gènes comme Rpl19, Gapdh, Hsp90 ou Ldha pour l’évaluation de l’expression de notre gène d’intérêt?

Answer 16

Ce sont des housekeeping genes = genes non-affectés par un traitement, leur expression permet de quantifier la PCR

Question 17

Par qPCR, Quelles est la technique principalement utilisée pour quantifier les ARN complémentaires provenant de deux populations de cellules?

Answer 17

??

Question 18

-Par qPCR, Quelles est la technique principalement utilisée pour connaitre la concentration de l’ADN viral dans un tissu infecté.

Answer 18

??

Question 19

Quel est l’avantage d’utiliser des analyses d’expression comme les puces à ADN ou le séquençage de nouvelle génération plutôt que la RT-PCR/qPCR?

Answer 19

L’analyse d’expression permet l’ancrage de 20 000 oligonucléotides sur une surface de 1cm2 = matrice pour les réactions d’hybridation