RNA Interferenz in Eukaryoten Flashcards
Was sind zwei Beispiele von RNA-mediated Gene Silencing?
- RNA-Interferenz (RNAi) oder Post-transcriptional gene silencing (PTGS)
- Transcriptional gene silencing (TGS)
Was ist RNA-Interferenz (RNAi) oder Post-transcriptional gene silencing (PTGS)?
Kleine doppelsträngige RNA-Moleküle führen in Assoziation mit einem zellulären Proteinkomplex zur sequenzspezifischen Suppression der Target-Genexpression durch Spaltung der Target-mRNA
Was ist Transcriptional gene silencing (TGS)?
Inhibition der Transkription durch epigenetische Modifikation des Chromatins (z.B. Rekrutierung von Histon- und DNA-modifizier enden Enzymen)
Rätselhafte experimentelle Daten (1990) mit dem Ziel: kräftigere Blütenfarbe in Petunien.
Was war der experimentelle Ansatz und desen Ergebnis?
- Experimenteller Ansatz: Insertion eines Transgens zur Bildung von violetten Pigmenten
- Ergebnis: Viele Blumen verloren die Farbe, anstatt mehr Pigmente auszubilden
- Beobachtung: Deutliche Erniedrigung der endogenen als auch der transgenen mRNA
-> Ko-Suppression homologer Gene - Der Phänotyp blieb über Monate erhalten, übertrug sich auf wachsende Pflanzenteile und war vererbbar
Schlüsselexperiment in Caenorhabditis elegans (1998) mit dem Target Gen: unc .22 (kodiert für ein nicht essentielles Myofilament Protein).
Was wurde beobachtet?
- Keine oder marginale Effekte mit sense RNA (identisch mit unc 22 mRNA) oder antisense RNA (komplementär zur mRNA)
- Bewegungsdefekte mit doppelsträngiger (ds) unc 22 RNA; Verlust der Muskelkontrolle führt zu unkoordinierten („ unc “) Bewegungen und sichtbaren Zuckungen
Weiterführende Experimente mit muscle excess3 (mex-3).
Welcher Zusammenhang besteht zwischen Injektion von dsRNA und gene silencing?
Nach Injektion von mex-3 dsRNA, Verlust der natürlichen mex-3 mRNA
-> Keine endogene mex-3 mRNA detektierbar (D)
-> Injizierte dsRNA bewirkt eine potente und spezifische Interferenz der targetierten mRNA (RNA-Interferenz (RNAi))
Wo wird mex-3 exprimiert? Was ist seine Rolle?
- Expression von mex-3 in Gonaden und Embryonen
- Aufrechterhaltung der Totipotenz in den Keimzellen und Spezifikation des Zellschicksals im frühen Embryo
Wodurch wird gene silencing effizient?
durch dsRNA
Wofür ist RNA-Interferenz komplementär?
für komplementäre mRNA
Wogegen muss der dsRNA für RNA-Interferenz gerichtet sein?
dsRNA muss gegen reife mRNA-Sequenz gerichtet sein, nicht gegen Promotorregionen oder Introns
(Hinweis auf post transkriptionellen Mechanismus im Zyt plasma)
Schlussfolgerungen RNA-Interferenz
- Effizientes gene silencing nur durch dsRNA
- Spezifisch für komplementäre mRNA
- Degradation der mRNA
- dsRNA muss gegen reife mRNA-Sequenz gerichtet sein, nicht gegen Promotorregionen oder Introns
(Hinweis auf post transkriptionellen Mechanismus im Zyt plasma) - Bereits wenige Moleküle ausreichend für vollen Effekt
(Katalytische Aktivität oder Amplifikationsschritt) - Effekt kann sich in Geweben ausbreiten (systemische RNAi) und vererbt werden
In welchen Organismen kommt RNA-Interferenz vor?
- Pilzen („Quelling“)
- Pflanzen („Co-Suppression“)
- Tieren: Fruchtfliege ( Drosophila melanogaster), Nematoden (Caenorhabditis elegans), Zebrafisch, Säuger
Einige Ausnahmen: z. B. Saccharomyces cerevisiae
Welcher Effakt hat RNA-Interferenz in Säugerzellen?
- lange dsRNAs lösen unspezifische Immunantwort aus
- kurze dsRNAs (18-30 Nukleotide) werden toleriert
- führen zur transienten, aber sehr effizienten Suppression
Was sind die grundlegenden Schritten des RNAi-Mechanismus?
- Dicer-vermittelte dsRNA-Prozessierung
- Bildung des RNA-induced silencing complex (RISC)
- Guide-Strang-Selektion
* Passenger (sense)-Strang wird gespalten und aus RISC entfernt - Target-mRNA-Erkennung & Spaltung
* Der guide (antisense)-Strang bindet über komplementäre Basenpaarung an die Target-mRNA
* Endonukleolytische Spaltung der mRNA durch AGO - RISC-Recycling
* Die gespaltene Target-mRNA wird aus RISC entfernt
* RISC kann über den guide-Strang weitere Target-mRNA binden und spalten
Was ist die Funktion der Dicer?
Dicer spaltet lange dsRNA in kurze siRNA (20–25 nt) (small interfering RNA)
Wie entsteht RISC (RNA-induced silencing complex)?
Übergabe der siRNA mit Hilfe von Dicer (+ dsRNA-bindendes Protein (dsRBP)) an Argonauten-Protein (AGO)
Wlecher Strang wird bei der Guide-Strang-Selektion während der RNA-Interferenz gespalten?
Passenger (sense)-Strang wird gespalten und aus RISC entfernt
Wie groß ist der Dicer? Welche Domäne hat er? Wie ist seine Tertiärstruktur?
- ca. 200 kDa
- Multidomänenprotein
- L-förmige Tertiärstruktur
- Helicase clamp: „catch and feed motion“ - Förderlich für die Prozessivität
- Helicase – DUF – Platform – PAZ – Ruler - RNase IIIa – RNase IIIb – dsRBD
Welcher Typ von Enzym ist der Dicer? Was ist seine Funktion?
- Endoribonuklease aus der RNase III Familie
- Spaltung langer dsRNA in kurze dsRNA Fragmente von 20-25 nt Länge (= siRNA)
Wir groß sind die Argonauten Proteine (AGO)? Welche Domäne haben sie?
- ca. 100 kDa
- PIWI-Domäne
Welche Funktion haben Argonauten Proteine (AGO)?
katalytische Komponente von AGO: RNase H-ähnliche Faltung mit katalytischer Tetrade (AspGluAspHis)
Was ist ein RNA-induced silencing complex (RISC)?
- großer Ribonukleoprotein Komplex
- minimaler RISC = guide RNA und AGO
Was sind Eigenschaften von siRNA-Molekülen?
- Monophosphat Gruppe an beiden 5‘-Enden
- An beiden 3‘-Enden: 3‘-Hydroxylgruppe & 2 Nukleotide Überhang
- Spaltstelle zwischen Nukleotid 10 und 11 vom 5‘-Ende der guide RNA
- Passenger oder sense Strang
- identisch mit mRNA
- Spaltung durch AGO2
- Entfernung aus RISC
- Degradation durch andere
- Ribonukleasen
- Guide oder antisense Strang
- komplementär zur mRNA
- definiert Spaltstelle sowohl im passenger Strang als auch in der Target mRNA
Wo ist die Spaltstelle am siRNA?
Spaltstelle zwischen Nukleotid 10 und 11 vom 5‘-Ende der guide RNA
Was befindet sich an beiden 5‘-Enden des siRNAs?
Monophosphat Gruppe
Was befindet sich an beiden 3‘-Enden des siRNAs?
3‘-Hydroxylgruppe & 2 Nukleotide Überhang
Was sind Eigenschaften vom Passenger oder sense Strang?
- identisch mit mRNA
- Spaltung durch AGO2
- Entfernung aus RISC
- Degradation durch andere Ribonukleasen
Was sind Eigenschaften vom Guide oder antisense Strang?
- komplementär zur mRNA
- definiert Spaltstelle sowohl im passenger Strang als auch in der Target mRNA
Wie viele von den Schlüsselproteine kommen in Caenorhabditis elegans vor?
- 27 Argonauten Proteine
RDE1: Interaktion mit primären siRNAs
WAGOs: Interaktion mit sekundären siRNAs - 1 Dicer
Wie viele von den Schlüsselproteine kommen in Arabidopsis thaliana vor?
- 10 Argonauten Proteine
Slicer Aktivität in 5 AGOs - 4 Dicer (Dicer-like)
DCL1 = miRNA Biogenese (PTGS)
DCL2 = Produktion viraler siRNAs (PTGS)
DCL3 = Heterochromatin-Stilllegung (TGS)
Wie viele von den Schlüsselproteine kommen in Mensch vor?
- 4 Argonauten-Proteine (PTGS)
Slicer-Aktivität nur in Ago2 - 1 Dicer
Was sind Funktionen von RNAi?
- RNAi schützt Pflanzen, Würmer und Insekten vor Pathogenen wie Viren, Bakterien und Pilze
- RNAi erhält die Stabilität des Genoms aufrecht durch silencing mobiler Elemente (Transposons)
- RNAi ähnlicher Mechanismus übt transkriptionelles gene silencing aus, führt zur Modulation von Chromatin und kann vererbt werden
- ein RNAi ähnlicher Mechanismus (microRNAs) reguliert die Expression vieler Gene in Säugern
Was sind Anwendungsbereiche von RNAi?
- RNAi stellt ein neues experimentelles Tool zur gezielten Untersuchung spezifischer Gene dar (siRNA-mediated knockdowns)
- RNAi als Therapieansatz
- RNAi zur Bekämpfung von Pflanzenschädlingen
Wie wird RNAi zur Abtötung von Pflanzenschädlingen prinzipiell angewendet?
Entwicklung von dsRNAs zu Spezies-spezifische Insektizide
Was wäre eine Besispiel für RNAi zur Abtötung von Pflanzenschädlingen?
Beispiel: Transgene Kartoffelpflanzen, die dsRNAs gegen essentielle Gene des Kartoffelkäfers in Chloroplasten oder im Cytoplasma bilden
- Insertion des Transgens ins Chloroplasten-Genom (keine RNAi und kein Dicer keine Degredation der dsRNAs)
- Pflanzenzellen produzieren lange dsRNAs (≥ 60 nts)
- Effiziente dsRNA Aufnahme durch Darmzellen
* Käfer überleben:
- Insertion des Transgens ins nukleäre Genom
- Bildung von kleinen siRNAs durch Dicer im Cytoplasma
- Ineffiziente Aufnahme der siRNA durch Darmzellen
Wie führt RNAi zur Abtötung von Pflanzenschädlingen?
- Käfer sterben:
- Insertion des Transgens ins Chloroplasten-Genom (keine RNAi und kein Dicer -> keine Degredation der dsRNAs)
- Pflanzenzellen produzieren lange dsRNAs (≥ 60 nts)
- Effiziente dsRNA Aufnahme durch Darmzellen
- Käfer überleben:
- Insertion des Transgens ins nukleäre Genom
- Bildung von kleinen siRNAs durch Dicer im Cytoplasma
- Ineffiziente Aufnahme der siRNA durch Darmzellen
Wie wird RNAi als Abwehrmechanismus –Antivirale RNAi angewendet?
- RNA-dependent RNA-polymerase (RdRP)
- Replikation von RNA anhand einer RNA-Vorlage
- RISC verwendet die siRNA als Vorlage (Guide Strang ist komplementär zur viralen RNA), um virale RNAs auf sequenzspezifische Weise zu binden und abzubauen
- katalytische Domäne entfernt verwandt mit DNA-abhängigen RNA Polymerasen
Wo kommt der Abwehrmechanismus –Antivirale RNAi vor?
existieren in C. elegans, Pflanzen und Pilzen
Was passiert bei der Entstehung von primären siRNAs während der Amplifikation des RNAi-Effekts?
- Dicer-Produkte mit 5‘-Monophosphatgruppe und 2 nts-3‘-Überhänge
- Assoziieren mit primary AGO (RDE-1) (RDE: RNAi-defective)
- Der Komplex bestehend aus siRNA-RDE-1 bindet an Target-RNA
- Rekrutierung der RdRP RRF-1 (RRF1: RNA-dependent RNA polymerase Family)
Was passiert bei der Entstehung von sekundären siRNAs (22 nts) während der Amplifikation des RNAi-Effekts?
- De novo Synthese durch die RdRP RRF-1
- Entstehen upstream der primären siRNA
- Antisense in Bezug auf Target-RNA
- Tragen 5‘-Triphosphatgruppe
- Primer-unabhängige Synthese
- Hoher Level an sek. siRNAs
- Targetieren einen größeren Sequenzbereich der Target-RNA
- Assoziieren mit WAGO (WAGO: Worm-specific AGO)
- Spaltung der viralen RNA
Was sind die drei mögliche Mechanismen von RNAi in Pflanzen?
- Gene silencing durch exogene RNA-Trigger
- Gene silencing endogener mRNAs durch miRNAs
- Transcriptional gene silencing (TGS)
Was passiert bei Gene silencing durch exogene RNA-Trigger?
Virusabwehr, RdRP-vermittelte Amplifikation von sekundären siRNAs
Was passiert bei Gene silencing endogener mRNAs durch miRNAs?
Regulation der Genexpression durch Inhibition der Translation oder RNA-Degradation
Was passiert bei Transcriptional gene silencing (TGS)?
DNA-Methylierung und Histonmodifikation, Transkriptionshemmung
