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Molekularbiologie > Gentherapie > Flashcards

Gentherapie Flashcards

1
Q

Was ist Gentherapie?

A

Einbringen von Erbsubstanz in einen Organismus zu therapeutischen Zwecken

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2
Q

Nenne Methoden zum Gentransfer.

A
  • Transfektion (chemisch); z.B. Calziumphosphat, Liposomen
  • Transfektion (physikalisch); z.B. „gene gun“ / Partikel Elektroporation, Magnetofektion
  • Transduktion; gentechnisch veränderte Viren
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3
Q

Was sind wesentliche Aspekte bei der Vektor Konstruktion?

A
  • Klonierungskapazität
  • Titer
  • Zelltropismus (Pseudotypisierung)
  • Verpackungszellinien
  • Selektionsmarker (v.a. ex vivo
  • episomal / integrativ (Stabilität)
  • Promotoraktivität
  • Toxizität
  • Immunogenität
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4
Q

Welche Gentranfser-Methode ist ex vivo effektiv, aber in vivo nicht wirksam

A

Retroviren sind ex vivo sehr effektiv (+++), aber in vivo unwirksam (-)

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5
Q

Welche zwei Methoden sind sowohl ex vivo als auch in vivo hochwirksam?

A

Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren (AAV).

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6
Q

Wie effektiv sind physikalische Methoden für den ex vivo und in vivo Gentransfer?

A

Physikalische Methoden sind für beide Anwendungen mit +/- bewertet, was auf eine geringe bis moderate Wirksamkeit hinweist.

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7
Q

Welcher virale Vektor integriert sein genetisches Material in das Wirtsgenom und ist am besten für ex vivo Anwendungen geeignet?

A

Retroviren integrieren ihr genetisches Material und sind am besten für ex vivo Anwendungen geeignet.

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8
Q

Welche Gentranfser-Methoden sind ex vivo hochwirksam, aber in vivo nur moderat wirksam?

A

Liposomen und Herpesviren.

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9
Q

Welche Elements sind im retroviralen Genom zu finden?

A

[5‘ LTR – psi – gag-pro-pol-env -3‘ LTR]

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10
Q

Wie ist die genetische Information des retroviralen Genoms gespeichert? Wie groß ist es?

A
  • diploide einzelstrang RNA positiver Polarität
  • 7 - 10 kB
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11
Q

Welche Elements sind in retrovirale Vektoren zu finden?

A

[5‘ LTR – psi – Zielprotein – Antibiotika-Res. – 3‘ LTR]

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12
Q

Wie groß ist der Titer und die Kapazität von Retrovirusvektoren?

A
  • Titer 10^5 -10^7 inf. Partikel /ml
  • Kapazität: max. 8 kB Fremdsequenz
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13
Q

Ist eine direkte gentechnische Manipulation des Vektors möglich bei Retrovirusvektoren?

A

Ja

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14
Q

Sind Retrovirusvektoren wirtspezifisch?

A

breites Wirtszellspektrum

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15
Q

Können Retrovirusvektoren in Zellen integrieren?

A

Integration an zufälliger Stelle in das Wirtsgenom

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16
Q

Können Retrovirusvektoren in Zellen replizieren?

A

effektive Integration nur in teilungsaktiven Zellen

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17
Q

Müssen Retrovirusvektoren verpackt werden?

A

Ja (Verpackungszellinien; gag-pol, env)

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18
Q

Wie ist die genetische Information des adenoviralen Genoms gespeichert? Wie groß ist es?

A
  • doppelstrang DNA
  • 36 - 48 kB
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19
Q

Wie groß ist der Titer und die Kapazität von Adenovirusvektoren?

A
  • Titer bis 10^12 inf. Partikel/ml
  • Kapazität: max. 35 kB Fremdsequenz (abh. von Del. im Genom)
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20
Q

Ist eine direkte gentechnische Manipulation des Vektors möglich bei Adenovirusvektoren?

A

keine direkte gentechnische Manipulation des Vektors möglich

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21
Q

Sind Adenovirusvektoren wirtspezifisch?

A

hohe Wirtszellspezifität

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22
Q

Können Adenovirusvektoren in Zellen integrieren?

A

keine Integration in das Wirtsgenom (episomal)

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23
Q

Können Adenovirusvektoren in Zellen replizieren?

A

effektive Replikation unabhängig von Teilungsaktivität der Zellen

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24
Q

Müssen Adenovirusvektoren in trans komplementiert werden?

A

Ja, (293 Helferzellinien; E1 Gen)

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25
Q

What are the steps of the adenovirus life cycle?

A

Adenovirus life cycle:
1. Binding to Host Cell: Adenovirus attaches to the host cell membrane via receptor/integrin interactions.
2. Internalization: The virus enters the host cell through endocytosis.
3. pH-Dependent Endosome Release: A drop in endosomal pH triggers the release of the viral particle from the endosome into the cytoplasm.
4. Nuclear Translocation: The viral DNA is transported to the nucleus.
5. DNA Replication: Inside the nucleus, the viral DNA is replicated as an episomal (non-integrated) genome.
6. Transcription: The viral DNA is transcribed into mRNA in the nucleus
7. Translation: The mRNA is translated into viral proteins in the cytoplasm.
8. Virus Assembly and Packaging: Newly synthesized viral DNA and proteins assemble into new virus particles in the nucleus.
9. Cell Lysis: The host cell undergoes lysis, releasing newly formed virus particles to infect other cells.

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26
Q

Was ist eine Strategie zur Manipulation des Adenovirusgenoms?

A

Replikationsdefekt über Genomdeletion

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27
Q

Was sind Strategien zur Manipulation großer viraler Genome? Wofür ist es häfig verwendet?

A
  1. homologe Rekombination
  2. Bacterial Artificial Chromosome
    * Häufig verwendet für Knockout/Knockin Technologien (Mausgenetik)
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28
Q

Was sind die allgemeine Schritte einer homologen Rekombination?

A
  • Zielgen flankiert von viraler Sequenz in Plasmid
  • Kotransfektion von Genom und Plasmid in Zelle
  • Rekombination, Selektion
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29
Q

Was ist ein BAC (Bacterial Artificial Chromosome)? Wie groß kann ein Insert sein? Wie ist die Stabilität davon?

A
  • künstliches bakterielles Chromosom
  • abgeleitet von F-Plasmid (single copy)
  • bis 300 kB Insert z.B. vollständiges Virusgenom
  • sehr stabil
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30
Q

Wodurch kann BAC zur Manipulation benutzt werden?

A

Manipulation möglich über „Recombineering“ mittels RecE/RecT des Rac-Prophagen oder red-System (Redα,-β, -γ) des Bakteriophagen l

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31
Q

Können Menschen seropositiv für AAV sein?

A
  • 80-90% der Erwachsenen sind seropositiv für AAV2
  • große Zahl von Serotypen bekannt
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32
Q

Worüber kann Tropismus, z.T. auch über Mutagenese- und Selektionsansätze, gesteuert werden?

A

Serotyp

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33
Q

Wie ist die genetische Information des adeno assoziierten Genoms gespeichert? Wie groß ist es?

A
  • kleines einzelstrang-DNA Genom
  • 4,7 kB Länge
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34
Q

Wie groß ist die Kapazität von AAV Vektoren?

A

Kapazität: max. 4,7 kB

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35
Q

Können adeno assoziierte Viren replizieren?

A

Alleine nicht; Replikation in Wirtszellen abhängig von Adenovirus-Koinfektion bei AAV Vektoren

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36
Q

Können adeno assoziierte Viren in Zellen integrieren?

A
  • ohne Helfervirus erfolgt nach Infektion, Genomintegration im Chromosom 19 (19q13.3-qter)
  • ohne Rep-Gen-Expression unterbleibt Integration bei AAV Vektoren; Genom bleibt episomal erhalten (Mechanismus noch unklar)
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37
Q

Sind AVV Vektoren wirtspezifisch?

A

Ja, jedoch in einem breiten Spektrum von Wirtszellen einsetzbar

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38
Q

Warum sind AAV besonders attraktiv für die Anwendung in der Gentherapie?

A
  • keine Krankheit assoziiert; nicht pathogen
  • abhängig von Helferviren
  • episomale DNA; keine Genomintegration
  • hohe Sicherheit
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39
Q

Was müssen AAV Vektoren enthalten?

A

Vektor muss nur die beiden „inverted terminal repeats (ITR)“ (je 150 Basen) enthalten; dazwischen Fremdgen (transgene payload) einklonieren
keine rep- oder cap-Gene

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40
Q

Welche Faktoren sind für die DNA Replikation, Transkription, virale Verpackung und virale Translation wichtig?

A

Adenoviralen Proteine: E1A, E2A, E4 und VA RNA

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41
Q

Welche Faktoren wurden von den Helferzellen für AAV bereitgestellt?

A

E1, E2, E4, VA RNA Gene

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42
Q

Was ist mit Promotokontrolle in der Gentherapie gemeint?

A

Genexpression erfolgt nur in bestimmten Geweben

43
Q

Was ist der Promotor im Leber?

A

Albumin

44
Q

Was ist der Promotor in Muskeln?

A

Myosin light chain-1

45
Q

Was sind Promotor in Tumoren?

A

Tyrosine Kinase (B16 Melanom)
DF3/MUC1 (Brustkrebs)
Afetoprotein (Hepatom)

46
Q

Was sind Anwendungsmöglichkeiten für Promotorkontrolle in der Gentherapie?

A
  • genetisch bedingte Erkrankungen
  • Onkologie
  • Infektionskrankheiten/ z.B. AIDS
47
Q

Was sind die Voraussetzungen zur Anwendung von Promotorkontrolle in der Gentherapie?

A
  • schwere Erkrankung
  • ungünstige Prognose
  • keine konventionelle Therapie verfügbar
48
Q

Was sind die Voraussetzungen zur Anwendung von Promotorkontrolle bei genetisch bedingter Erkrankungen?

A
  • einzelnes Gen ist defekt (monogener Defekt)
  • rezessiver Defekt
  • Gen liegt in klonierter Form vor
49
Q

Was sind die Ausschlusskriterien bei der Anwendung von Promotorkontrolle für genetisch bedingte Erkrankungen?

A
  • zusätzliche Chromosomen, z.B. Trisomie 21
  • Verlust von Chromosomen, z.B. Turner Syn.
  • Translokation von Chromosomen, z.B. chronisch myloische Leukämie
  • Deletion von Chromosomenabschnitt, z.B. Prader Willi Syndrom
  • polygene Krankheiten, z.B. Adipositas Hypertonus, Tumore (?), Rheuma
50
Q

Nenne Beispiele für monogene Krankheiten.

A
  • familiäre Hypercholesterinämie
  • Faktor VIII Mangel
  • Mukoviszidose oder zystische Fibrose
  • ADA SCID
  • severe combined immundeficiency syndrome (X linked SCID)
51
Q

Was passiert bei familiärer Hypercholesterinämie?

A
  • Extrem hoher Cholesterinspiegel
  • Arteriosklerose
  • Herzinfarkt oft bereits im Alter von 20 Jahren
52
Q

Was ist der Grund und die Folge von familiärer Hypercholesterinämie?

A
  • Grund: fehlen des „low density lipoprotein“ Rezeptors
  • Folge: gestörte Cholesterin Aufnahme in der Leber
53
Q

Was ist der Therapieansatz gegen familiäre Hypercholesterinämie?

A

Ex vivo -Gentherapie an der Leber; Übertragung des LDL-Rezeptorgens durch infusierte retrovirale Vektoren

54
Q

Was passiert bei Faktor VIII Mangel?

A
  • verminderte oder fehlende Blutgerinnung durch Mangel an Enzym (Protease) in der Blutgerinnungskaskade
  • Gen hat 186 kb (26 Exons); 9 kb cDNA
55
Q

Was ist die Folge von Faktor VIII Mangel?

A

Folge: Hämophilie A

56
Q

Was ist der Therapieansatz gegen Faktor VIII Mangel?

A

Einbringen von funktionellem Gen; Über AAV Vektor Factor VIII Gen erfolgreich übertragen

57
Q

Was passiert bei Mukoviszidose oder zystische Fibrose?

A

Defekt im Cystic Fibrosis-Transmembrane Regulator Protein

58
Q

Was ist der Grund und die Folge von Mukoviszidose oder zystische Fibrose?

A
  • Grund: Ionenkanaldefekt in Zellmembran der Schleimhautzellen der Lunge
  • Folge: lebensbedrohliche Verschleimung der Lunge; Schleim wird nicht ausgehustet weil Wasser durch Kanaldefekt fehlt
59
Q

Was ist der Therapieansatz gegen Mukoviszidose oder zystische Fibrose?

A

Einbringen von funktionellem Gen; In vivo -Gentherapie: einbringen des Cystic Fibrosis-Transmembrane Regulator Gens durch inhalierte adeno assoziierte virale Vektoren

60
Q

Was passiert bei ADA SCID?

A
  • Adenosin Desaminase Defekt; fatal disorder of purine metabolism and immunodeficiency
  • Adenosin und 2‘ Deoxyadenosin akkumulieren in allen Körperzellen; v.a. für unreife lymphoide Zellen toxisch
61
Q

Was ist der Grund und die Folge von ADA SCID?

A
  • Grund: Dysfunktion B und T Zellen, Absterben von Immunzellen
  • Folge: verminderte zelluläre und humorale Immunantwort, führt zur Immundefizienz
62
Q

Was war die konventionelle Therapiegegen ADA SCID?

A

Enzymersatztherapie

63
Q

Was war der erste Therapieansatz gegen ADA SCID?

A

Einbringen von funktionellem Gen

64
Q

Was ist der neue Therapieansatz gegen ADA SCID?

A
  • Intaktes Gen über retroviralen Vektor (Lentiviraler Vector) in Hematopoetische Stammzellen einbringen
  • Vorläufer Stammzellen aus dem Knochenmark des Patienten isoliert, ex vivo vermehrt und mit Vektor transduziert
65
Q

Was sind methoden zum Gentransfer von infektiösen Viren / Virusvektoren?

A
  • intravenöse Injektion (systemisch)
  • intraoperative Applikation in Tumorhöhle (lokal)
  • Inhalation
    Beachte: Tropismus des Vektors und Gewebsspezifität des Promotors
66
Q

Was können Komplikation bei der Gentherapie gegen monogene Krankheiten sein?

A
  • dominante monogene Erkrankung
  • defektes Protein wird exprimiert und ist pathogen
67
Q

Was können Lösungsversuche bei der Gentherapie gegen monogene Krankheiten sein?

A
  • Gene replacement
  • Suppression der Genexpression
68
Q

Was passiert bei Severe combined immunodeficiency syndrome (X-SCID)?

A

Interleukin-2 Rezeptorgen gamma-Kette defekt; ist essentieller Bestandteil von: IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 Rezeptor

69
Q

Was ist der Grund und die Folge von Severe combined immunodeficiency syndrome (X-SCID)?

A
  • Grund: keine IL-2 usw. Bindung, keine Zelldifferenzierung
  • Folge: wenige oder keine reifen T-Zellen, schwere Immundefizienz „bubble boy disease“
70
Q

Was ist der Therapieansatz gegen Severe combined immunodeficiency syndrome (X-SCID)?

A

Einbringen von funktionellem Gen für die gamma-Kette des Interleukin-2 Rezeptors

71
Q

Was ist die Vorgehensweise des Therapieansatz gegen Severe combined immunodeficiency syndrome (X-SCID)?

A
  1. Stammzellen aus dem Knochenmark der Patienten isoliert
  2. mit rekombinanten Retroviren infiziert (Transduktion von funkt. Gen)
  3. Stammzellen zurück in den Patienten
    * Gentransfer über retroviralen Vektor
72
Q

Wogegen war der erste erfolgreiche gentherapeutischer Ansatz weltweit?

A

gegen Severe combined immunodeficiency syndrome (X-SCID)
* behandelte Kinder sind immunkompetent, führen über Zeitraum von 3 Jahren normales Leben

73
Q

Wie kann das Risiko durch Immunantwort gegen virale Vektoren vermieden werden?

A
  • Screening auf bestehende Immunität bei Patienten.
  • Optimierung der Dosierung und der Verabreichungsmechanismen.
  • Entwicklung sicherer Vektorsysteme, wie z. B. AAVs oder nicht-viraler Methoden, um Immunreaktionen zu minimieren
74
Q

2 der Patienten entwickelten Leukämie nach der Gentherapie gegen X-SCID. Was ist passiert?

A
  • Insertion der Vektor-DNA erfolgte bei beiden erkrankten Patienten an identischer Genomposition stromaufwärts von LMO-2 Gen/Transkriptionsfaktor; evtl. Proto-Onkogen
  • Gentransfer erfolgte mit Retrovirusvektor: Integriert mit Zielgen in das Wirtsgenoman
    -unbekannter
    -zufälliger (?) Position
    Risiko: Insertionsmutagenese führt zu Entartung der Zelle!
75
Q

Was war der neue Ansatz, um Leukämie also side-effect von der Gentherapie gegen X-SCID zu vermeiden?

A
  • schwächerer Promotor und „self-inactivating Retroviral Vector“
  • integriertes Provirus hat keine LTR mit Promotoraktivität
  • Virus backbone kann dadurch keine Genexpression antreiben
  • Expression erfolgt somit ausschließlich über internen Promotor (geringere Gefahr der Aktivierung zellulärer Gene)
    (-> Lentiviral Gene Therapy Combined with low-dose Busulfan in Infants with SCID-X1)
76
Q

Was passiert bei Wiskott-Aldrich Syndrom?

A
  • Defekt im Wiskott–Aldrich syndrome protein (WASp): 502 AS Protein das Aktinpolymerisation in Blutzellen reguliert
  • wird nur in hämatopoetischen Zellen exprimiert
  • X chromosomal kodiert
77
Q

Was ist die Folge von Wiskott-Aldrich Syndrom?

A

Schwere Immunsuppression sowie Blutgerinnungsstörung

78
Q

Was ist der Therapieansatz gegen Wiskott-Aldrich Syndrom?

A

Self-inactivating HIV-1-Vektor der das native Gen unter dem authentischen Promotor in Blutstammzellen exprimiert

79
Q

Bei welchen Gentherapien war Leukämie ein side-effect?

A
  • Severe combined immunodeficiency syndrome (X-SCID)
  • Wiskott-Aldrich Syndrom (erneut Insertion beim LMO2 Lokus)
80
Q

Was ist der gentherapeutische Ansatz in der Krebstherapie?

A
  • Rekombinanter T-Zellrezeptor erkennt Tumormarkerprotein MART-1 auf Melanom-Zellen
  • Einführen eines synthetischen Rezeptors mit einer Antigen-Bindungsdomäne, die von einem Antikörper stammt, gekoppelt an eine signalübertragende Endodomäne, die vom nativen T-Zell-Rezeptor abgeleitet ist.
81
Q

Was sind CAR-T Zellen?

A
  • Haben einen synthetischen Rezeptor mit einer Antigen-bindenden Domäne aus einem Antikörper, der an eine vom nativen T-Zell-Rezeptor abgeleitete signalübertragende Endodomäne gekoppelt ist
  • Chimäre Antigenrezeptoren (CARs) haben somit die Spezifität eines Antikörpers, der an die zytotoxischen Effektormechanismen der T-Zelle gekoppelt ist
  • Werden normalerweise ex vivo (im Labor) erzeugt, aber jetzt werden auch Versuche entwickelt, sie in vivo (im Körper) zu erzeugen
82
Q

Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and anti-tumor activity in individuals with neuroblastoma.
Was waren Problembereiche bei den T-Zellen mit Spezifität für nicht virale Tumormarker? Was war der Grund dafür?

A
  • Keine Langzeitpersistenz
  • Keine effektive Zelllyse
  • Grund: (u. a.) Fehlen der Wirkung kostimulatorischer Moleküle bei rekomb. TCR
    (Ektodomäne von AK gegen MART-1; nur Endodomäne von TCR-nicht genug für T-Zellaktivierung)
83
Q

Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and anti-tumor activity in individuals with neuroblastoma.
Was war der Lösungsansatz für die Probleme bei den T-Zellen mit Spezifität für nicht virale Tumormarker?

A
  • Im Patienten existieren bereits Epstein Barr Virus (EBV) spezifische CTLs
  • Werden durch persistierendes latentes EBV-Antigen über APCs ständig stimuliert
  • Einführen eines zusätzlichen maßgeschneiderten chimären Antigenrezeptors gegen Diasialogangliosid GD2 (nicht viraler Tumormarker in humanen Neuroblastomen)
  • Führt zu spezifischer Lyse von Neuroblastomzellen durch persistierende CTL-Population
  • Verlängerter therapeutischer Effekt, selektiv für EBV spez. CTLs
  • Verbreiterung der Spezifität auf weitere Krebsarten möglich
84
Q

What elements are combined in Chimeric Antigen Receptors (CARs)?

A

These are synthetic receptors that combine:
* The antigen-binding domain from an antibody (to recognize tumor antigens like GD2).
* The intracellular signaling domains (like TCR signaling components) to activate the T cells.

85
Q

Was sind Beispiele für die Anwednung von CAR T-Zellen als Therapie?

A

Kymriah against B-cell acute lymphoblastic leukemia (ALL) & Yescartafor large B-cell lymphoma -a type of non-Hodgkin lymphoma.

86
Q

Stammzelltherapie als Alternative zur Gentherpie?
Beispiel: Phenotypic correction of murine hemophilia A using an iPS cell-based therapy.
Was wat der Therpaieansatz am Anfang in diesem Fall?

A
  • Murine iPS Fibroblastenzellen von Schwanzspitze
  • Ectopische Expression von 3 Transkriptionsfaktoren, Oct4, Sox2 und Klf4 induziert pluripotente Stammzellen (iPS)
  • Differenziert zu Endothelialzelle und Endothelial Progenitorzellen, welche Faktor VIII produzieren/sekretieren
  • Injektion der Zellen in Leber von Hämophilie A Mäusen führt zu Korrektur des Gendefekts bis zu 90 Tagen p.T.
87
Q

Stammzelltherapie als Alternative zur Gentherpie?
Beispiel: Phenotypic correction of murine hemophilia A using an iPS cell-based therapy.
Was waren die Risiken bei der Stammzelltherapie?

A
  • Pluripotente Stammzellen bilden Tumore
  • Dürfen nicht als Verunreinigung mit appliziert werden
88
Q

Stammzelltherapie als Alternative zur Gentherpie?
Beispiel: Phenotypic correction of murine hemophilia A using an iPS cell-based therapy.
Genereller Weg zur Therapie monogener Defekte auch beim Menschen?

A

z.B. Wiskott Aldrich Syn.

89
Q

Stammzelltherapie als Alternative zur Gentherpie?
Beispiel: Phenotypic correction of murine hemophilia A using an iPS cell-based therapy.
Was war das neue, verbesserte Alternative?

A

Über AAV Vektor Factor VIII Gen erfolgreich übertragen

90
Q

Was ist Rot-Grün-Farbenblindheit?

A
  • single locus genetic disorder
  • X-chromosomal
  • 8% of male (XY) population
91
Q

Was war der Therapieansatz gegen Rot-Grün-Farbenblindheit, der bei Affen getest wurde?

A

monkeys red-green blind from birth -> serotype 2/5 recombinant adeno-associated virus (rAAV) containing a human L-opsin gene under the control of the L/M-opsin enhancer and promoter

92
Q

Was war das Ergebnis der Gentherapie gegen Rot-Grün-Farbenblindheit bei Affen?

A
  • third type of cone pigment (opsin) added to dichromatic retinas
  • adult (!) monkeys (no need for preexisting neuronal connections!)
  • 20 weeks after virus injection correction of colour vision
93
Q

Wie ist die Forschung gerade für Gentherapie gegen Rot-Grün-Farbenblindheit bei Menschen?

A

rAAV2 product for a congenital form of blindness is currently under review in the United States

94
Q

Was passiert bei Hämophilie B?

A

Faktor IX Defekt/Mangel

95
Q

Was ist die Therapie gegen Hämophilie B?

A

Adenovirus-Associated Virus Vector Mediated Gene Transfer in Hemophilia B

96
Q

Was ist „genome editing“?

A
  • ist eine Art genetisches Immunsystem von Bakterien gegen Phagen
  • anwendbar auch in menschlichen Zellen
  • Gentherapie ohne Gentransfervektor möglich.
97
Q

Was ist CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)?

A

Abschnitte sich wiederholender DNA-Sequenzblöcke bei Bakterien und Archaea

98
Q

Was ist Cas (CRISPR associated)?

A
  • Cas Proteine (CRISPR associated) binden sequenzspezifisch RNA; 40 Familien
  • Cas9 ist eine Endonuklease und bindet an 22 Basen lange crRNA repeat Sequenz
  • Über artifizielle guide RNA kann Zielsequenz im humanen Genom geschnitten oder über Adenosin zu Guanosin Konversion modifiziert werden
99
Q

Was sind Beispiele für die Anwedung des CRISPR/Cas Systems als Therapie?

A
  • editing of the sickle-cell disease allele in the β-globin gene
  • CRISPR/Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis (dominanten Gendefekt -> toxisches Genprodukt)
100
Q

Was ist die neue Version der Genom Editierung?

A

Prime editing

101
Q

Wie war die alte Version von Genome Editing?

A

Alte Version:
* Doppelstrangschnitt durch Cas9
* Bereitstellung von dsDNA mit korrekter Sequenz
* Einbau korrekter Sequenz durch DS Bruch repair System der Zelle (ineffizient)

102
Q

Wie ist die neue Version von Genome Editing?

A

Neue Version:
* „search and replace“ Technik
* Cas9 Mutante die nur einen DNA-Strang schneiden kann (Nickase)
* Bereitstellung von langer guide RNA mit korrekter Template Sequenz
* Cas9 ist fusioniert an Reverse Transcriptase (RT)
* Cas9 bindet über guide RNA an die DNA, Nick, Verlängerung durch RT mit guide RNA als Template

103
Q

Was sind die Schritte von Prime Editing?

A
  1. Nicking of PAM Strand
  2. Hybridization of primer-binding site to PAM strand
  3. Reverse transcription
  4. Hybridization of DNA strands and flap cleavage (3’ flap cleavage -> edit is removed / 5’ flap cleavage  enables editing)
  5. Ligation and mismatch repair

Molekularbiologie (9 decks)

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