Gentherapie Flashcards
1
Q
Was ist Gentherapie?
A
Einbringen von Erbsubstanz in einen Organismus zu therapeutischen Zwecken
2
Q
Nenne Methoden zum Gentransfer.
A
- Transfektion (chemisch); z.B. Calziumphosphat, Liposomen
- Transfektion (physikalisch); z.B. „gene gun“ / Partikel Elektroporation, Magnetofektion
- Transduktion; gentechnisch veränderte Viren
3
Q
Was sind wesentliche Aspekte bei der Vektor Konstruktion?
A
- Klonierungskapazität
- Titer
- Zelltropismus (Pseudotypisierung)
- Verpackungszellinien
- Selektionsmarker (v.a. ex vivo
- episomal / integrativ (Stabilität)
- Promotoraktivität
- Toxizität
- Immunogenität
4
Q
Welche Gentranfser-Methode ist ex vivo effektiv, aber in vivo nicht wirksam
A
Retroviren sind ex vivo sehr effektiv (+++), aber in vivo unwirksam (-)
5
Q
Welche zwei Methoden sind sowohl ex vivo als auch in vivo hochwirksam?
A
Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren (AAV).
6
Q
Wie effektiv sind physikalische Methoden für den ex vivo und in vivo Gentransfer?
A
Physikalische Methoden sind für beide Anwendungen mit +/- bewertet, was auf eine geringe bis moderate Wirksamkeit hinweist.
7
Q
Welcher virale Vektor integriert sein genetisches Material in das Wirtsgenom und ist am besten für ex vivo Anwendungen geeignet?
A
Retroviren integrieren ihr genetisches Material und sind am besten für ex vivo Anwendungen geeignet.
8
Q
Welche Gentranfser-Methoden sind ex vivo hochwirksam, aber in vivo nur moderat wirksam?
A
Liposomen und Herpesviren.
9
Q
Welche Elements sind im retroviralen Genom zu finden?
A
[5‘ LTR – psi – gag-pro-pol-env -3‘ LTR]
10
Q
Wie ist die genetische Information des retroviralen Genoms gespeichert? Wie groß ist es?
A
- diploide einzelstrang RNA positiver Polarität
- 7 - 10 kB
11
Q
Welche Elements sind in retrovirale Vektoren zu finden?
A
[5‘ LTR – psi – Zielprotein – Antibiotika-Res. – 3‘ LTR]
12
Q
Wie groß ist der Titer und die Kapazität von Retrovirusvektoren?
A
- Titer 10^5 -10^7 inf. Partikel /ml
- Kapazität: max. 8 kB Fremdsequenz
13
Q
Ist eine direkte gentechnische Manipulation des Vektors möglich bei Retrovirusvektoren?
A
Ja
14
Q
Sind Retrovirusvektoren wirtspezifisch?
A
breites Wirtszellspektrum
15
Q
Können Retrovirusvektoren in Zellen integrieren?
A
Integration an zufälliger Stelle in das Wirtsgenom
16
Q
Können Retrovirusvektoren in Zellen replizieren?
A
effektive Integration nur in teilungsaktiven Zellen
17
Q
Müssen Retrovirusvektoren verpackt werden?
A
Ja (Verpackungszellinien; gag-pol, env)
18
Q
Wie ist die genetische Information des adenoviralen Genoms gespeichert? Wie groß ist es?
A
- doppelstrang DNA
- 36 - 48 kB
19
Q
Wie groß ist der Titer und die Kapazität von Adenovirusvektoren?
A
- Titer bis 10^12 inf. Partikel/ml
- Kapazität: max. 35 kB Fremdsequenz (abh. von Del. im Genom)
20
Q
Ist eine direkte gentechnische Manipulation des Vektors möglich bei Adenovirusvektoren?
A
keine direkte gentechnische Manipulation des Vektors möglich
21
Q
Sind Adenovirusvektoren wirtspezifisch?
A
hohe Wirtszellspezifität
22
Q
Können Adenovirusvektoren in Zellen integrieren?
A
keine Integration in das Wirtsgenom (episomal)
23
Q
Können Adenovirusvektoren in Zellen replizieren?
A
effektive Replikation unabhängig von Teilungsaktivität der Zellen
24
Q
Müssen Adenovirusvektoren in trans komplementiert werden?
A
Ja, (293 Helferzellinien; E1 Gen)
25
What are the steps of the adenovirus life cycle?
Adenovirus life cycle:
1. Binding to Host Cell: Adenovirus attaches to the host cell membrane via receptor/integrin interactions.
2. Internalization: The virus enters the host cell through endocytosis.
3. pH-Dependent Endosome Release: A drop in endosomal pH triggers the release of the viral particle from the endosome into the cytoplasm.
4. Nuclear Translocation: The viral DNA is transported to the nucleus.
5. DNA Replication: Inside the nucleus, the viral DNA is replicated as an episomal (non-integrated) genome.
6. Transcription: The viral DNA is transcribed into mRNA in the nucleus
7. Translation: The mRNA is translated into viral proteins in the cytoplasm.
8. Virus Assembly and Packaging: Newly synthesized viral DNA and proteins assemble into new virus particles in the nucleus.
9. Cell Lysis: The host cell undergoes lysis, releasing newly formed virus particles to infect other cells.
26
Was ist eine Strategie zur Manipulation des Adenovirusgenoms?
Replikationsdefekt über Genomdeletion
27
Was sind Strategien zur Manipulation großer viraler Genome? Wofür ist es häfig verwendet?
1. homologe Rekombination
2. Bacterial Artificial Chromosome
* Häufig verwendet für Knockout/Knockin Technologien (Mausgenetik)
28
Was sind die allgemeine Schritte einer homologen Rekombination?
* Zielgen flankiert von viraler Sequenz in Plasmid
* Kotransfektion von Genom und Plasmid in Zelle
* Rekombination, Selektion
29
Was ist ein BAC (Bacterial Artificial Chromosome)? Wie groß kann ein Insert sein? Wie ist die Stabilität davon?
* künstliches bakterielles Chromosom
* abgeleitet von F-Plasmid (single copy)
* bis 300 kB Insert z.B. vollständiges Virusgenom
* sehr stabil
30
Wodurch kann BAC zur Manipulation benutzt werden?
Manipulation möglich über „Recombineering“ mittels RecE/RecT des Rac-Prophagen oder red-System (Redα,-β, -γ) des Bakteriophagen l
31
Können Menschen seropositiv für AAV sein?
* 80-90% der Erwachsenen sind seropositiv für AAV2
* große Zahl von Serotypen bekannt
32
Worüber kann Tropismus, z.T. auch über Mutagenese- und Selektionsansätze, gesteuert werden?
Serotyp
33
Wie ist die genetische Information des adeno assoziierten Genoms gespeichert? Wie groß ist es?
* kleines einzelstrang-DNA Genom
* 4,7 kB Länge
34
Wie groß ist die Kapazität von AAV Vektoren?
Kapazität: max. 4,7 kB
35
Können adeno assoziierte Viren replizieren?
Alleine nicht; Replikation in Wirtszellen abhängig von Adenovirus-Koinfektion bei AAV Vektoren
36
Können adeno assoziierte Viren in Zellen integrieren?
* ohne Helfervirus erfolgt nach Infektion, Genomintegration im Chromosom 19 (19q13.3-qter)
* ohne Rep-Gen-Expression unterbleibt Integration bei AAV Vektoren; Genom bleibt episomal erhalten (Mechanismus noch unklar)
37
Sind AVV Vektoren wirtspezifisch?
Ja, jedoch in einem breiten Spektrum von Wirtszellen einsetzbar
38
Warum sind AAV besonders attraktiv für die Anwendung in der Gentherapie?
* keine Krankheit assoziiert; nicht pathogen
* abhängig von Helferviren
* episomale DNA; keine Genomintegration
* hohe Sicherheit
39
Was müssen AAV Vektoren enthalten?
Vektor muss nur die beiden „inverted terminal repeats (ITR)“ (je 150 Basen) enthalten; dazwischen Fremdgen (transgene payload) einklonieren
keine rep- oder cap-Gene
40
Welche Faktoren sind für die DNA Replikation, Transkription, virale Verpackung und virale Translation wichtig?
Adenoviralen Proteine: E1A, E2A, E4 und VA RNA
41
Welche Faktoren wurden von den Helferzellen für AAV bereitgestellt?
E1, E2, E4, VA RNA Gene
42
Was ist mit Promotokontrolle in der Gentherapie gemeint?
Genexpression erfolgt nur in bestimmten Geweben
43
Was ist der Promotor im Leber?
Albumin
44
Was ist der Promotor in Muskeln?
Myosin light chain-1
45
Was sind Promotor in Tumoren?
Tyrosine Kinase (B16 Melanom)
DF3/MUC1 (Brustkrebs)
Afetoprotein (Hepatom)
46
Was sind Anwendungsmöglichkeiten für Promotorkontrolle in der Gentherapie?
* genetisch bedingte Erkrankungen
* Onkologie
* Infektionskrankheiten/ z.B. AIDS
47
Was sind die Voraussetzungen zur Anwendung von Promotorkontrolle in der Gentherapie?
* schwere Erkrankung
* ungünstige Prognose
* keine konventionelle Therapie verfügbar
48
Was sind die Voraussetzungen zur Anwendung von Promotorkontrolle bei genetisch bedingter Erkrankungen?
* einzelnes Gen ist defekt (monogener Defekt)
* rezessiver Defekt
* Gen liegt in klonierter Form vor
49
Was sind die Ausschlusskriterien bei der Anwendung von Promotorkontrolle für genetisch bedingte Erkrankungen?
* zusätzliche Chromosomen, z.B. Trisomie 21
* Verlust von Chromosomen, z.B. Turner Syn.
* Translokation von Chromosomen, z.B. chronisch myloische Leukämie
* Deletion von Chromosomenabschnitt, z.B. Prader Willi Syndrom
* polygene Krankheiten, z.B. Adipositas Hypertonus, Tumore (?), Rheuma
50
Nenne Beispiele für monogene Krankheiten.
* familiäre Hypercholesterinämie
* Faktor VIII Mangel
* Mukoviszidose oder zystische Fibrose
* ADA SCID
* severe combined immundeficiency syndrome (X linked SCID)
51
Was passiert bei familiärer Hypercholesterinämie?
* Extrem hoher Cholesterinspiegel
* Arteriosklerose
* Herzinfarkt oft bereits im Alter von 20 Jahren
52
Was ist der Grund und die Folge von familiärer Hypercholesterinämie?
* Grund: fehlen des „low density lipoprotein“ Rezeptors
* Folge: gestörte Cholesterin Aufnahme in der Leber
53
Was ist der Therapieansatz gegen familiäre Hypercholesterinämie?
Ex vivo -Gentherapie an der Leber; Übertragung des LDL-Rezeptorgens durch infusierte retrovirale Vektoren
54
Was passiert bei Faktor VIII Mangel?
* verminderte oder fehlende Blutgerinnung durch Mangel an Enzym (Protease) in der Blutgerinnungskaskade
* Gen hat 186 kb (26 Exons); 9 kb cDNA
55
Was ist die Folge von Faktor VIII Mangel?
Folge: Hämophilie A
56
Was ist der Therapieansatz gegen Faktor VIII Mangel?
Einbringen von funktionellem Gen; Über AAV Vektor Factor VIII Gen erfolgreich übertragen
57
Was passiert bei Mukoviszidose oder zystische Fibrose?
Defekt im Cystic Fibrosis-Transmembrane Regulator Protein
58
Was ist der Grund und die Folge von Mukoviszidose oder zystische Fibrose?
* Grund: Ionenkanaldefekt in Zellmembran der Schleimhautzellen der Lunge
* Folge: lebensbedrohliche Verschleimung der Lunge; Schleim wird nicht ausgehustet weil Wasser durch Kanaldefekt fehlt
59
Was ist der Therapieansatz gegen Mukoviszidose oder zystische Fibrose?
Einbringen von funktionellem Gen; In vivo -Gentherapie: einbringen des Cystic Fibrosis-Transmembrane Regulator Gens durch inhalierte adeno assoziierte virale Vektoren
60
Was passiert bei ADA SCID?
* Adenosin Desaminase Defekt; fatal disorder of purine metabolism and immunodeficiency
* Adenosin und 2‘ Deoxyadenosin akkumulieren in allen Körperzellen; v.a. für unreife lymphoide Zellen toxisch
61
Was ist der Grund und die Folge von ADA SCID?
* Grund: Dysfunktion B und T Zellen, Absterben von Immunzellen
* Folge: verminderte zelluläre und humorale Immunantwort, führt zur Immundefizienz
62
Was war die konventionelle Therapiegegen ADA SCID?
Enzymersatztherapie
63
Was war der erste Therapieansatz gegen ADA SCID?
Einbringen von funktionellem Gen
64
Was ist der neue Therapieansatz gegen ADA SCID?
* Intaktes Gen über retroviralen Vektor (Lentiviraler Vector) in Hematopoetische Stammzellen einbringen
* Vorläufer Stammzellen aus dem Knochenmark des Patienten isoliert, ex vivo vermehrt und mit Vektor transduziert
65
Was sind methoden zum Gentransfer von infektiösen Viren / Virusvektoren?
* intravenöse Injektion (systemisch)
* intraoperative Applikation in Tumorhöhle (lokal)
* Inhalation
Beachte: Tropismus des Vektors und Gewebsspezifität des Promotors
66
Was können Komplikation bei der Gentherapie gegen monogene Krankheiten sein?
* dominante monogene Erkrankung
* defektes Protein wird exprimiert und ist pathogen
67
Was können Lösungsversuche bei der Gentherapie gegen monogene Krankheiten sein?
* Gene replacement
* Suppression der Genexpression
68
Was passiert bei Severe combined immunodeficiency syndrome (X-SCID)?
Interleukin-2 Rezeptorgen gamma-Kette defekt; ist essentieller Bestandteil von: IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 Rezeptor
69
Was ist der Grund und die Folge von Severe combined immunodeficiency syndrome (X-SCID)?
* Grund: keine IL-2 usw. Bindung, keine Zelldifferenzierung
* Folge: wenige oder keine reifen T-Zellen, schwere Immundefizienz „bubble boy disease“
70
Was ist der Therapieansatz gegen Severe combined immunodeficiency syndrome (X-SCID)?
Einbringen von funktionellem Gen für die gamma-Kette des Interleukin-2 Rezeptors
71
Was ist die Vorgehensweise des Therapieansatz gegen Severe combined immunodeficiency syndrome (X-SCID)?
1. Stammzellen aus dem Knochenmark der Patienten isoliert
2. mit rekombinanten Retroviren infiziert (Transduktion von funkt. Gen)
3. Stammzellen zurück in den Patienten
* Gentransfer über retroviralen Vektor
72
Wogegen war der erste erfolgreiche gentherapeutischer Ansatz weltweit?
gegen Severe combined immunodeficiency syndrome (X-SCID)
* behandelte Kinder sind immunkompetent, führen über Zeitraum von 3 Jahren normales Leben
73
Wie kann das Risiko durch Immunantwort gegen virale Vektoren vermieden werden?
* Screening auf bestehende Immunität bei Patienten.
* Optimierung der Dosierung und der Verabreichungsmechanismen.
* Entwicklung sicherer Vektorsysteme, wie z. B. AAVs oder nicht-viraler Methoden, um Immunreaktionen zu minimieren
74
2 der Patienten entwickelten Leukämie nach der Gentherapie gegen X-SCID. Was ist passiert?
* Insertion der Vektor-DNA erfolgte bei beiden erkrankten Patienten an identischer Genomposition stromaufwärts von LMO-2 Gen/Transkriptionsfaktor; evtl. Proto-Onkogen
* Gentransfer erfolgte mit Retrovirusvektor: Integriert mit Zielgen in das Wirtsgenoman
-unbekannter
-zufälliger (?) Position
Risiko: Insertionsmutagenese führt zu Entartung der Zelle!
75
Was war der neue Ansatz, um Leukämie also side-effect von der Gentherapie gegen X-SCID zu vermeiden?
* schwächerer Promotor und „self-inactivating Retroviral Vector“
* integriertes Provirus hat keine LTR mit Promotoraktivität
* Virus backbone kann dadurch keine Genexpression antreiben
* Expression erfolgt somit ausschließlich über internen Promotor (geringere Gefahr der Aktivierung zellulärer Gene)
(-> Lentiviral Gene Therapy Combined with low-dose Busulfan in Infants with SCID-X1)
76
Was passiert bei Wiskott-Aldrich Syndrom?
* Defekt im Wiskott–Aldrich syndrome protein (WASp): 502 AS Protein das Aktinpolymerisation in Blutzellen reguliert
* wird nur in hämatopoetischen Zellen exprimiert
* X chromosomal kodiert
77
Was ist die Folge von Wiskott-Aldrich Syndrom?
Schwere Immunsuppression sowie Blutgerinnungsstörung
78
Was ist der Therapieansatz gegen Wiskott-Aldrich Syndrom?
Self-inactivating HIV-1-Vektor der das native Gen unter dem authentischen Promotor in Blutstammzellen exprimiert
79
Bei welchen Gentherapien war Leukämie ein side-effect?
* Severe combined immunodeficiency syndrome (X-SCID)
* Wiskott-Aldrich Syndrom (erneut Insertion beim LMO2 Lokus)
80
Was ist der gentherapeutische Ansatz in der Krebstherapie?
* Rekombinanter T-Zellrezeptor erkennt Tumormarkerprotein MART-1 auf Melanom-Zellen
* Einführen eines synthetischen Rezeptors mit einer Antigen-Bindungsdomäne, die von einem Antikörper stammt, gekoppelt an eine signalübertragende Endodomäne, die vom nativen T-Zell-Rezeptor abgeleitet ist.
81
Was sind CAR-T Zellen?
* Haben einen synthetischen Rezeptor mit einer Antigen-bindenden Domäne aus einem Antikörper, der an eine vom nativen T-Zell-Rezeptor abgeleitete signalübertragende Endodomäne gekoppelt ist
* Chimäre Antigenrezeptoren (CARs) haben somit die Spezifität eines Antikörpers, der an die zytotoxischen Effektormechanismen der T-Zelle gekoppelt ist
* Werden normalerweise ex vivo (im Labor) erzeugt, aber jetzt werden auch Versuche entwickelt, sie in vivo (im Körper) zu erzeugen
82
Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and anti-tumor activity in individuals with neuroblastoma.
Was waren Problembereiche bei den T-Zellen mit Spezifität für nicht virale Tumormarker? Was war der Grund dafür?
* Keine Langzeitpersistenz
* Keine effektive Zelllyse
* Grund: (u. a.) Fehlen der Wirkung kostimulatorischer Moleküle bei rekomb. TCR
(Ektodomäne von AK gegen MART-1; nur Endodomäne von TCR-nicht genug für T-Zellaktivierung)
83
Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and anti-tumor activity in individuals with neuroblastoma.
Was war der Lösungsansatz für die Probleme bei den T-Zellen mit Spezifität für nicht virale Tumormarker?
* Im Patienten existieren bereits Epstein Barr Virus (EBV) spezifische CTLs
* Werden durch persistierendes latentes EBV-Antigen über APCs ständig stimuliert
* Einführen eines zusätzlichen maßgeschneiderten chimären Antigenrezeptors gegen Diasialogangliosid GD2 (nicht viraler Tumormarker in humanen Neuroblastomen)
* Führt zu spezifischer Lyse von Neuroblastomzellen durch persistierende CTL-Population
* Verlängerter therapeutischer Effekt, selektiv für EBV spez. CTLs
* Verbreiterung der Spezifität auf weitere Krebsarten möglich
84
What elements are combined in Chimeric Antigen Receptors (CARs)?
These are synthetic receptors that combine:
* The antigen-binding domain from an antibody (to recognize tumor antigens like GD2).
* The intracellular signaling domains (like TCR signaling components) to activate the T cells.
85
Was sind Beispiele für die Anwednung von CAR T-Zellen als Therapie?
Kymriah against B-cell acute lymphoblastic leukemia (ALL) & Yescartafor large B-cell lymphoma -a type of non-Hodgkin lymphoma.
86
Stammzelltherapie als Alternative zur Gentherpie?
Beispiel: Phenotypic correction of murine hemophilia A using an iPS cell-based therapy.
Was wat der Therpaieansatz am Anfang in diesem Fall?
* Murine iPS Fibroblastenzellen von Schwanzspitze
* Ectopische Expression von 3 Transkriptionsfaktoren, Oct4, Sox2 und Klf4 induziert pluripotente Stammzellen (iPS)
* Differenziert zu Endothelialzelle und Endothelial Progenitorzellen, welche Faktor VIII produzieren/sekretieren
* Injektion der Zellen in Leber von Hämophilie A Mäusen führt zu Korrektur des Gendefekts bis zu 90 Tagen p.T.
87
Stammzelltherapie als Alternative zur Gentherpie?
Beispiel: Phenotypic correction of murine hemophilia A using an iPS cell-based therapy.
Was waren die Risiken bei der Stammzelltherapie?
- Pluripotente Stammzellen bilden Tumore
- Dürfen nicht als Verunreinigung mit appliziert werden
88
Stammzelltherapie als Alternative zur Gentherpie?
Beispiel: Phenotypic correction of murine hemophilia A using an iPS cell-based therapy.
Genereller Weg zur Therapie monogener Defekte auch beim Menschen?
z.B. Wiskott Aldrich Syn.
89
Stammzelltherapie als Alternative zur Gentherpie?
Beispiel: Phenotypic correction of murine hemophilia A using an iPS cell-based therapy.
Was war das neue, verbesserte Alternative?
Über AAV Vektor Factor VIII Gen erfolgreich übertragen
90
Was ist Rot-Grün-Farbenblindheit?
* single locus genetic disorder
* X-chromosomal
* 8% of male (XY) population
91
Was war der Therapieansatz gegen Rot-Grün-Farbenblindheit, der bei Affen getest wurde?
monkeys red-green blind from birth -> serotype 2/5 recombinant adeno-associated virus (rAAV) containing a human L-opsin gene under the control of the L/M-opsin enhancer and promoter
92
Was war das Ergebnis der Gentherapie gegen Rot-Grün-Farbenblindheit bei Affen?
* third type of cone pigment (opsin) added to dichromatic retinas
* adult (!) monkeys (no need for preexisting neuronal connections!)
* 20 weeks after virus injection correction of colour vision
93
Wie ist die Forschung gerade für Gentherapie gegen Rot-Grün-Farbenblindheit bei Menschen?
rAAV2 product for a congenital form of blindness is currently under review in the United States
94
Was passiert bei Hämophilie B?
Faktor IX Defekt/Mangel
95
Was ist die Therapie gegen Hämophilie B?
Adenovirus-Associated Virus Vector Mediated Gene Transfer in Hemophilia B
96
Was ist „genome editing“?
* ist eine Art genetisches Immunsystem von Bakterien gegen Phagen
* anwendbar auch in menschlichen Zellen
* Gentherapie ohne Gentransfervektor möglich.
97
Was ist CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)?
Abschnitte sich wiederholender DNA-Sequenzblöcke bei Bakterien und Archaea
98
Was ist Cas (CRISPR associated)?
* Cas Proteine (CRISPR associated) binden sequenzspezifisch RNA; 40 Familien
* Cas9 ist eine Endonuklease und bindet an 22 Basen lange crRNA repeat Sequenz
* Über artifizielle guide RNA kann Zielsequenz im humanen Genom geschnitten oder über Adenosin zu Guanosin Konversion modifiziert werden
99
Was sind Beispiele für die Anwedung des CRISPR/Cas Systems als Therapie?
* editing of the sickle-cell disease allele in the β-globin gene
* CRISPR/Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis (dominanten Gendefekt -> toxisches Genprodukt)
100
Was ist die neue Version der Genom Editierung?
Prime editing
101
Wie war die alte Version von Genome Editing?
Alte Version:
* Doppelstrangschnitt durch Cas9
* Bereitstellung von dsDNA mit korrekter Sequenz
* Einbau korrekter Sequenz durch DS Bruch repair System der Zelle (ineffizient)
102
Wie ist die neue Version von Genome Editing?
Neue Version:
* „search and replace“ Technik
* Cas9 Mutante die nur einen DNA-Strang schneiden kann (Nickase)
* Bereitstellung von langer guide RNA mit korrekter Template Sequenz
* Cas9 ist fusioniert an Reverse Transcriptase (RT)
* Cas9 bindet über guide RNA an die DNA, Nick, Verlängerung durch RT mit guide RNA als Template
103
Was sind die Schritte von Prime Editing?
1. Nicking of PAM Strand
2. Hybridization of primer-binding site to PAM strand
3. Reverse transcription
4. Hybridization of DNA strands and flap cleavage (3’ flap cleavage -> edit is removed / 5’ flap cleavage enables editing)
5. Ligation and mismatch repair
