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Bakterielles Abwehrsystem: CRISPR/Cas Flashcards

1
Q

Was ist CRISPR/Cas?

A
  • Verteidigungsmechanismus gegen Fremd-DNA (Bakteriophagen, Archaeen-Viren und Plasmide)
  • „Adaptive und vererbbare Immunität“
  • Vermittelt Resistenz gegen das Eindringen von Fremd-DNA
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2
Q

Wo kommt CRISPR/Cas vor?

A

Vorkommen in Prokaryoten: Bakterien (~45%), Archaeen (~90%)

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3
Q

Was sind die zwei wichtigen Komponenten von CRISPR/Cas?

A
  1. CRISPR-array
  2. cas-Gene
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4
Q

Was ist CRISPR-array?

A

Abschnitte sich wiederholender DNA (repeats) im Genom von Bakterien
(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)

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5
Q

Was sind die cas-Gene?

A

Kodieren für eine große und heterogene Gruppe an Proteinen, die an der Abwehr beteiligt sind (CRISPR-associated)

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6
Q

Was sind die Komponente der CRISPR/Cas-Systeme

A

Leader, CRISPR-Array und Cas-Gen

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7
Q

Wie lang ist der Leader? Was enthält er?

A
  • Länge: ~100-500 bp
  • Enthält Promotor zur Transkription des CRISPR-Lokus
  • AT-reiche Region
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8
Q

Was sind die Komponente des CRISPR-Arrays?

A

Repeat und Spacer

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9
Q

Wie lang sind Repeats? Wie viele sind in einem CRISPR/Cas-System?

A
  • Länge ~20 bis ~50 Bp
  • Pro Lokus: 2 bis einige Hunderte idente Repeats
  • Oft palindromische Sequenz
  • Sequenz und Länge abhängig vom CRISPR-Typ und vom Organismus
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10
Q

Wie lang sind Spacers? Wie viele sind in einem CRISPR/Cas-System?

A
  • Länge: meist ~20 bis ~70 Bp
  • Pro Lokus: 1 bis einige Hunderte
  • Hypervariable Sequenzen im CRISPR-Array
  • Entstammen der DNA von Viren und Plasmiden
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11
Q

Welches Komponent am Virus-DNA ist wichtig für das CRISPR/Cas-System?

A

Pre-spacer

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12
Q

Woraus besteht der Pre-Spacer am Virus-DNA?

A

Protospacer und PAM

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13
Q

Was ist der Proto-Spacer?

A
  • Sequenzabschnitt in Fremd-DNA (z.B. Phage)
  • Verkürzte, prozessierte DNA wird als Spacer im CRISPR-Array eingebaut
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14
Q

Was lang ist der PAM (protospacer adjacent motif)? Was ist seine Rolle?

A
  • 2-5 Nukleotide lange Sequenz, die den Protospacer flankiert
  • Selektion des Protospacers durch Erkennung der PAM
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15
Q

Wie viele Cas-Gene sind im Cas-Operon enthalten?

A

3 bis mehr als 10 Cas-Gene

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16
Q

Wofür kodieren die Cas-Gene? Wo befinden sie sich?

A
  • kodieren für Cas-Proteine
  • befinden sich meist nahe eines CRISPR-Arrays
17
Q

Wofür beinhalten die Cas-Gene Domäne?

A
  • Domänen für Helikasen, Nukleasen, Polymerasen
  • Bindungsdomänen für DNA/RNA/Nukleotide
    -> Bilden mit Nukleinsäuren (DNA/RNA) Nukleoproteinkomplexe
18
Q

Was ist die Rolle von Cas-Proteine?

A
  • Cas-Proteine sind an der Spacer-Adaptation, der Biogenese von CRISPR-RNA und der Interferenz beteiligt
  • Bezüglich Anordnung, Orientierung und Anzahl sehr variable
19
Q

Wie sind die CRISPR/ Cas Systeme klassifiziert?

A
  • Klassifizierung in 2 Klassen und 6 CRISPR/Cas-Typen (I-VI) und mehr als 30 Subtypen
  • Klasse 1: Multiprotein-Effektor-Komplex
  • Klasse 2: Einzelnes-Effektor-Protein
20
Q

Wo befinden sich der CRISPR Loci bei den Klasse 1-Systeme?

A

Klasse 1-Systeme finden sich in 90% der CRISPR Loci in Bakterien & Archaeen

21
Q

Wo befinden sich der CRISPR Loci bei den Klasse 2-Systeme?

A

Klasse 2-Systeme finden sich in 10% der CRISPR Loci ausschließlich in Bakterien

22
Q

Was sind die drei Phasen des generellen Mechanismus vom Abwehrsystem CRISPR/Cas?

A

Phase 1: Adaptation (Akquirierung, Immunisierung)
Phase 2: Expression & Maturierung von crRNAs
Phase 3: Interferenz

23
Q

Was passiert in Phase 1 des Abwehrsystem CRISPR/Cas?

A

Phase 1: Adaptation (Akquirierung, Immunisierung)
* Erkennung der Fremd DNA nach Erstinfektion
* Fragmentierung der Fremd DANN
* Einbau in den CRISPR Lokus als neuen Spacer

24
Q

Was passiert in Phase 2 des Abwehrsystem CRISPR/Cas?

A

Phase 2: Expression & Maturierung von crRNAs
* Expression von Cas Genen
* Transkription des CRISPR Arrays zur Vorläufer RNA (pre-crRNA)
* Prozessierung in kleine CRISPR RNAs (crRNA)

25
Was passiert in Phase 3 des Abwehrsystem CRISPR/Cas?
Phase 3: Interferenz * Spezifische Erkennung und Abbau der Fremd DNA durch einen Komplex bestehend aus Cas Proteinen & crRNA (RNA-vermittelte DNA-Interferenz)
26
Wie wird der CRISPR Spacer adaptiert?
Adaptation von CRISPR Spacer * Fragmentierung der Fremd DNA * Selektion des Pre-Spacers durch Erkennung der PAM * Prozessierung des Pre-Spacers zum Protospacer * Spaltung des am Leader Ende liegenden Repeats im CRISPR Lokus * Integration des neuen Spacers; Cas1 und Cas2 bilden einen Komplex (Heterohexamerer Komplex) der die Spacer Integration bewerkstelligt * Auffüllen der jeweils fehlenden Repeat Sequenz (Repeat Verdopplung)
27
Welche Cas-Gene bilden meistens einen Komplex bei der Integreation des neuen Spacers?
* Die meisten CRISPR Cas Systeme enthalten Cas1, Cas2 * Heterohexamerer Komplex * Abhängig vom Typ unterstützen weitere Proteine den Adaptationsvorgang
28
Wie läuft die CRISPR-Prozessierung bei Typ I?
* Endoribonuclease (Cas6) * 3‘ handle bleibt mit Cas6 assoziiert * 5‘ handle für Positionierung im Überwachungskomplex wichtig
29
Wie läuft die CRISPR-Prozessierung bei Typ II?
* Basenpaarung zwischen tracrRNA und crRNA führt zur Bildung einer Doppelstrang-Region, die als Substrat für Cas9/ RNase III dient * Trimming durch unbekannte Ribonuklease; entfernt die 5‘-Repeat-Sequenz
30
Was ist tracrRNA?
Transactivating crRNA : ~25 nts lange Sequenz, ist komplementär zur Repeat Sequenz der crRNA
31
Was sind die Komponenten des Überwachungskomplexes bei Cascade Typ I-E Komplex?
Cascade Typ I-E Komplex: * Ribonukleoprotein Komplex: crRNA und Cas Proteinen (11 Untereinheiten von 5 Proteinen, 405 kDa) * 5 Proteine: Cas 6e, Cse 2 (Cas 11), Cas 7, Cas 5, Cas 8 * Cascade: CRISPR associated complex for antiviral defence
32
Was sind die Komponenten des Überwachungskomplexes bei Cascade Typ II-Komplex?
Cas9 Typ II-Komplex: * Ribonukleoprotein Komplex: crRNA/ tracrRNA und Cas9 Protein * Das crRNA/ tracrRNA Hybrid (No 5‘ handle, 20-nucleotide 3‘ handle) wird für die korrekte Verankerung und Positionierung in Cas9 benötigt
33
Wie läuft die CRISPR/ CasTyp I-vermittelte DNA-Interferenz?
1. Cascade-Komplex sucht Fremd-DNA nach Protospacer mit PAMs ab. Die PAM-Sequenz liegt auf dem zur crRNA komplementären DNA-Strang (Target-Strang) 2. Cas8 (Protein in Cascade) erkennt und bindet PAM der Target-DANN 3. Initiale Basenpaarung zwischen der crRNA-Seed-Sequenz (~7 nts) und der Target-DANN 4. Komplette Basenpaarung der crRNAmit der Spacer-Sequenz der Target-DANN führt zur Bildung eines R-Loops 5. Rekrutierung von Cas3 (Nuklease-Helikase) 6. Cas-3-vermittelte DNA-Degradation
34
Wie läuft die CRISPR/ CasTyp II-vermittelte DNA-Interferenz?
1. Cas9 crRNA tracrRNA Komplex sucht Fremd DNA nach Protospacer mit PAMs ab. Die PAM Sequenz liegt auf dem Non Target Strang, der zur crRNA nicht komplementär ist 2. Erkennung der PAM Sequenz durch Cas9 3. Initiale Basenpaarung zwischen der crRNA Seed Sequenz (~12 nts) und der Target DANN 4. Komplette Basenpaarung der crRNA mit der Spacer Sequenz der Target DANN führt zur Bildung eines R-Loops 5. Nukleaseaktivität von Cas9 spaltet die dsDNA 3 bp upstream von PAM, wobei Blunt-Enden generiert werden 6. DNA Degradation durch weitere DNasen
35
Was sind Anwendungen von CRISPR/ Cas System?
* Einbringen von Phagenresistenzen in industriell bedeutsame Bakterien (Milchsäurebakterien für die Käse und Dickmilchproduktion) * Identifizierung pathogener Bakterienstämme (universelle cas-Gene) * Knockdown von endogenen Genen durch Transformation Plasmid kodierter spezifischer CRISPR Sequenzen * Genome Editing in Eukaryonten
36
Wie läuft CRISPR/ Cas9-vermitteltes Genome Editing in Eukaryoten?
* Single guide RNA (sgRNA): Fusion aus crRNA und tracrRNA; führt die Cas9-Nuklease zur Ziel-DANN * Doppelstrangbrücheerzeugung - Reparatur durch: Nicht-homologe Endverknüpfung oder Homologe Reparatur * Nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ): Kann zu Indels (Insertionen oder Deletionen) führen * Indels (Deletionen und Insertionen) führen zum Funktionsverlust des Genproduktes * Homologe Reparatur (HDR): Ermöglicht präzise Genbearbeitung durch Integration eines Donor-DNA-Templates * Gezielte Genomeditierung: Präzise Änderungen in DNA-Sequenzen möglich.
37
Was sind Organismen, wo das breite Anwendungsspektrum Genome Editing benutzt wird?
- Menschliche Zellen - Zebrafische - Bakterien - Pflanzen - Nematoden - Mäuse
38
Was sind weitere Genome Editing Tools als Cas9?
z.B. Cas9 Nickase, Dead Cas9, etc.

Molekularbiologie (12 decks)

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