Bakterielles Abwehrsystem: CRISPR/Cas Flashcards
Was ist CRISPR/Cas?
- Verteidigungsmechanismus gegen Fremd-DNA (Bakteriophagen, Archaeen-Viren und Plasmide)
- „Adaptive und vererbbare Immunität“
- Vermittelt Resistenz gegen das Eindringen von Fremd-DNA
Wo kommt CRISPR/Cas vor?
Vorkommen in Prokaryoten: Bakterien (~45%), Archaeen (~90%)
Was sind die zwei wichtigen Komponenten von CRISPR/Cas?
- CRISPR-array
- cas-Gene
Was ist CRISPR-array?
Abschnitte sich wiederholender DNA (repeats) im Genom von Bakterien
(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)
Was sind die cas-Gene?
Kodieren für eine große und heterogene Gruppe an Proteinen, die an der Abwehr beteiligt sind (CRISPR-associated)
Was sind die Komponente der CRISPR/Cas-Systeme
Leader, CRISPR-Array und Cas-Gen
Wie lang ist der Leader? Was enthält er?
- Länge: ~100-500 bp
- Enthält Promotor zur Transkription des CRISPR-Lokus
- AT-reiche Region
Was sind die Komponente des CRISPR-Arrays?
Repeat und Spacer
Wie lang sind Repeats? Wie viele sind in einem CRISPR/Cas-System?
- Länge ~20 bis ~50 Bp
- Pro Lokus: 2 bis einige Hunderte idente Repeats
- Oft palindromische Sequenz
- Sequenz und Länge abhängig vom CRISPR-Typ und vom Organismus
Wie lang sind Spacers? Wie viele sind in einem CRISPR/Cas-System?
- Länge: meist ~20 bis ~70 Bp
- Pro Lokus: 1 bis einige Hunderte
- Hypervariable Sequenzen im CRISPR-Array
- Entstammen der DNA von Viren und Plasmiden
Welches Komponent am Virus-DNA ist wichtig für das CRISPR/Cas-System?
Pre-spacer
Woraus besteht der Pre-Spacer am Virus-DNA?
Protospacer und PAM
Was ist der Proto-Spacer?
- Sequenzabschnitt in Fremd-DNA (z.B. Phage)
- Verkürzte, prozessierte DNA wird als Spacer im CRISPR-Array eingebaut
Was lang ist der PAM (protospacer adjacent motif)? Was ist seine Rolle?
- 2-5 Nukleotide lange Sequenz, die den Protospacer flankiert
- Selektion des Protospacers durch Erkennung der PAM
Wie viele Cas-Gene sind im Cas-Operon enthalten?
3 bis mehr als 10 Cas-Gene
Wofür kodieren die Cas-Gene? Wo befinden sie sich?
- kodieren für Cas-Proteine
- befinden sich meist nahe eines CRISPR-Arrays
Wofür beinhalten die Cas-Gene Domäne?
- Domänen für Helikasen, Nukleasen, Polymerasen
- Bindungsdomänen für DNA/RNA/Nukleotide
-> Bilden mit Nukleinsäuren (DNA/RNA) Nukleoproteinkomplexe
Was ist die Rolle von Cas-Proteine?
- Cas-Proteine sind an der Spacer-Adaptation, der Biogenese von CRISPR-RNA und der Interferenz beteiligt
- Bezüglich Anordnung, Orientierung und Anzahl sehr variable
Wie sind die CRISPR/ Cas Systeme klassifiziert?
- Klassifizierung in 2 Klassen und 6 CRISPR/Cas-Typen (I-VI) und mehr als 30 Subtypen
- Klasse 1: Multiprotein-Effektor-Komplex
- Klasse 2: Einzelnes-Effektor-Protein
Wo befinden sich der CRISPR Loci bei den Klasse 1-Systeme?
Klasse 1-Systeme finden sich in 90% der CRISPR Loci in Bakterien & Archaeen
Wo befinden sich der CRISPR Loci bei den Klasse 2-Systeme?
Klasse 2-Systeme finden sich in 10% der CRISPR Loci ausschließlich in Bakterien
Was sind die drei Phasen des generellen Mechanismus vom Abwehrsystem CRISPR/Cas?
Phase 1: Adaptation (Akquirierung, Immunisierung)
Phase 2: Expression & Maturierung von crRNAs
Phase 3: Interferenz
Was passiert in Phase 1 des Abwehrsystem CRISPR/Cas?
Phase 1: Adaptation (Akquirierung, Immunisierung)
* Erkennung der Fremd DNA nach Erstinfektion
* Fragmentierung der Fremd DANN
* Einbau in den CRISPR Lokus als neuen Spacer
Was passiert in Phase 2 des Abwehrsystem CRISPR/Cas?
Phase 2: Expression & Maturierung von crRNAs
* Expression von Cas Genen
* Transkription des CRISPR Arrays zur Vorläufer RNA (pre-crRNA)
* Prozessierung in kleine CRISPR RNAs (crRNA)
Was passiert in Phase 3 des Abwehrsystem CRISPR/Cas?
Phase 3: Interferenz
* Spezifische Erkennung und Abbau der Fremd DNA durch einen Komplex bestehend aus Cas Proteinen & crRNA (RNA-vermittelte DNA-Interferenz)
Wie wird der CRISPR Spacer adaptiert?
Adaptation von CRISPR Spacer
* Fragmentierung der Fremd DNA
* Selektion des Pre-Spacers durch Erkennung der PAM
* Prozessierung des Pre-Spacers zum Protospacer
* Spaltung des am Leader Ende liegenden Repeats im CRISPR Lokus
* Integration des neuen Spacers; Cas1 und Cas2 bilden einen Komplex (Heterohexamerer Komplex) der die Spacer Integration bewerkstelligt
* Auffüllen der jeweils fehlenden Repeat Sequenz (Repeat Verdopplung)
Welche Cas-Gene bilden meistens einen Komplex bei der Integreation des neuen Spacers?
- Die meisten CRISPR Cas Systeme enthalten Cas1, Cas2
- Heterohexamerer Komplex
- Abhängig vom Typ unterstützen weitere Proteine den Adaptationsvorgang
Wie läuft die CRISPR-Prozessierung bei Typ I?
- Endoribonuclease (Cas6)
- 3‘ handle bleibt mit Cas6 assoziiert
- 5‘ handle für Positionierung im Überwachungskomplex wichtig
Wie läuft die CRISPR-Prozessierung bei Typ II?
- Basenpaarung zwischen tracrRNA und crRNA führt zur Bildung einer Doppelstrang-Region, die
als Substrat für Cas9/ RNase III dient - Trimming durch unbekannte Ribonuklease; entfernt die 5‘-Repeat-Sequenz
Was ist tracrRNA?
Transactivating crRNA : ~25 nts lange Sequenz, ist komplementär zur Repeat Sequenz der crRNA
Was sind die Komponenten des Überwachungskomplexes bei Cascade Typ I-E Komplex?
Cascade Typ I-E Komplex:
* Ribonukleoprotein Komplex: crRNA und Cas Proteinen (11 Untereinheiten von 5 Proteinen, 405 kDa)
* 5 Proteine: Cas 6e, Cse 2 (Cas 11), Cas 7, Cas 5, Cas 8
* Cascade: CRISPR associated complex for antiviral defence
Was sind die Komponenten des Überwachungskomplexes bei Cascade Typ II-Komplex?
Cas9 Typ II-Komplex:
* Ribonukleoprotein Komplex: crRNA/ tracrRNA und Cas9 Protein
* Das crRNA/ tracrRNA Hybrid (No 5‘ handle, 20-nucleotide 3‘ handle) wird für die korrekte Verankerung und Positionierung in Cas9 benötigt
Wie läuft die CRISPR/ CasTyp I-vermittelte DNA-Interferenz?
- Cascade-Komplex sucht Fremd-DNA nach Protospacer mit PAMs ab. Die PAM-Sequenz liegt auf dem zur crRNA komplementären DNA-Strang (Target-Strang)
- Cas8 (Protein in Cascade) erkennt und bindet PAM der Target-DANN
- Initiale Basenpaarung zwischen der crRNA-Seed-Sequenz (~7 nts) und der Target-DANN
- Komplette Basenpaarung der crRNAmit der Spacer-Sequenz der Target-DANN führt zur Bildung eines R-Loops
- Rekrutierung von Cas3 (Nuklease-Helikase)
- Cas-3-vermittelte DNA-Degradation
Wie läuft die CRISPR/ CasTyp II-vermittelte DNA-Interferenz?
- Cas9 crRNA tracrRNA Komplex sucht Fremd DNA nach Protospacer mit PAMs ab. Die PAM Sequenz liegt auf dem Non Target Strang, der zur crRNA nicht komplementär ist
- Erkennung der PAM Sequenz durch Cas9
- Initiale Basenpaarung zwischen der crRNA Seed Sequenz (~12 nts) und der Target DANN
- Komplette Basenpaarung der crRNA mit der Spacer Sequenz der Target DANN führt zur Bildung eines R-Loops
- Nukleaseaktivität von Cas9 spaltet die dsDNA 3 bp upstream von PAM, wobei Blunt-Enden generiert werden
- DNA Degradation durch weitere DNasen
Was sind Anwendungen von CRISPR/ Cas System?
- Einbringen von Phagenresistenzen in industriell bedeutsame Bakterien (Milchsäurebakterien für die Käse und Dickmilchproduktion)
- Identifizierung pathogener Bakterienstämme (universelle cas-Gene)
- Knockdown von endogenen Genen durch Transformation Plasmid kodierter spezifischer CRISPR Sequenzen
- Genome Editing in Eukaryonten
Wie läuft CRISPR/ Cas9-vermitteltes Genome Editing in Eukaryoten?
- Single guide RNA (sgRNA): Fusion aus crRNA und tracrRNA; führt die Cas9-Nuklease zur Ziel-DANN
- Doppelstrangbrücheerzeugung - Reparatur durch: Nicht-homologe Endverknüpfung oder Homologe Reparatur
- Nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ): Kann zu Indels (Insertionen oder Deletionen) führen
- Indels (Deletionen und Insertionen) führen zum Funktionsverlust des Genproduktes
- Homologe Reparatur (HDR): Ermöglicht präzise Genbearbeitung durch Integration eines Donor-DNA-Templates
- Gezielte Genomeditierung: Präzise Änderungen in DNA-Sequenzen möglich.
Was sind Organismen, wo das breite Anwendungsspektrum Genome Editing benutzt wird?
- Menschliche Zellen
- Zebrafische
- Bakterien
- Pflanzen
- Nematoden
- Mäuse
Was sind weitere Genome Editing Tools als Cas9?
z.B. Cas9 Nickase, Dead Cas9, etc.
