rekombinantna DNA Flashcards
stopnje kloniranja DNA
izrezovanje DNA
izbira male molekule DNA s sposobnostjo samorazmnoževanja
kovalentna združitev DNA fragmentov - DNA ligaza
prenos rekombinantne DNA iz epruvete v gostitelja
selekcija in identifikacija gostiteljskih celic z rekombinantno DNA
plazmidni vektor
v bakterijsko celico se vnesejo v procesu transformacije
najenostavnejši vektor za kloniranje je pBR322
*se mora podvojevati *mora bi majhen, da se loči od kromosomske DNA *vsebova mora prepoznavne markerje(označevalce –odpornost proti antibiotikom) za ugotavljanje prisotnosti konstrukta *ime mora le eno cepitveno mesto za določeno RE
transformacija (vnso tuje DNA v kompetentne bakt. celice)
*bakterije se skupaj s CaCl2inkubira na hladnem *nato se jih povrže T šoku (42 oC) *verjetna teorija: CaCl2veže negavno nabito DNA na LPS na površini bakterij
priprava rekombinantne DNA
tujo dvoverižno DNA lahko v vektor vstavimo na več načinov, najpogosteje je preko rezanja z restriktazami –> ligacija
za delovanje DNA ligaze je pomembna prosta 3’-OH skupina in fosforilna skupina na 5’ mestu
selekcija s pBR322
Tri možnos:
-celice brez plazmida ne preživijo v Amp in Tet
-celice s praznim plazmidom preživijo v Amp in Tet
-celice z rekombinantnim plazmidom preživijo v Tet ne pa v Amp
kako z bakteriofagi dobimo celoten genom
*genomsko DNA razrežemo z RE na več tisoč fragmentov *mešanico fragmentov ločimo z elektroforezo *izberemo fragmente s podobno velikostjo (15 kb) *s pomočjo encima pripnemo na fragmente nt (pripravimo lepljive konce) *fragmente vstavimo v bakteriofag z ustrezno pripravljenimi konci (500.000 klonov) *infeciramo E. coli, lizat celic vsebuje fragmente DNA v zadostnem št. virusnih delcev *končni rezultat je veliko št. celic, vsaka vsebuje drug fragment DNA *v tej mešanici je zastopan celotna izvorna genomska DNA
detekcija iskanega gena
*bakterijske celice z rekomb. DNA pusmo ras na agarni plošči *celice preraščajo ploščo, plakiso posledica lize (vsak vsebuje drugo rek. DNA) *DNA s plakov analiziramo s tehniko prenosa na membrano (nitrocelulozni papir) *naredimo repliko *papir obdelamo z raztopino NaOH, ki razgradi celice in spros rek. DNA, ki se denaturira in ostane vezana na papirju *pripravimo označene hibridizacijske sonde (pozna moramo vsaj del ak/nt zaporedja iskanega gena oz proteina, radioakvno označimo) *nitrocelulozno membrano z vezano rekombinantno DNA obdelamo z radioakvno sondo, veže se samo na iskani gen, dobimo lokacijo bakterijske kolonije z želeno rekomb. DNA
umetni kromosomi
bakterije ali kvasovke
dolge fragmente DNA (100 do 1000 kbp) lahko kloniramo s pomočjo umetnih kromosomov bakterije (BAC) ali kvasovke (YAC)
PCR tri stopnje
*denaturacijaizvorne (matrične) DNA, ki vsebuje zapis, ki ga želimo pomnoži
*vezavi dveh sintečnih oligonukleodov na začetek in konec odseka matrične DNA, ki ga želimo pomnožiti
*sinteze nove DNA s podaljševanjem začetnih oligonukleodov
Sangerjeva metoda za določanje nukleotidnega zaporedja
DIDEOKSI METODA
ddNTP (dideoksinukleozid trifosfat) prekine sintezo DNA, ker nima proste 3’OH skupine
uporabi se PCR reakcija z enim nukleodom in mešanico dNTP in ddNTP
za vsako reakcijo je osnovni dNTP radioakvno označen (npr. 32P-dATP)
avtomazirana metoda z uporabo fluorescenčno označenih ddNTP, različno dolgi fragmenti se separirajo na kapilarni elektroforezi(hitrejša ločba), namesto na PAGE
sinteza oligonukleotidov
reakcija adicije enega nt poteka v šrih stopnjah *deblokiranje dimetoksitrilne skupine *vezava naslednjega nt preko fosfitne triesterske vezi *acelacija preostale 5’ OH skupine *z reakcijo oksidacijese fosfitna skupina pretvori v fosfatni diester –vez med dvema nt
projekt človeški genom
hierarhično hitro sekvenciranje
*1980 so ZDA, VB, Francija, Nemčija Japonska, Kitajska, pod vodstvom Jamesa Wattsona dogovarjale za projekt *1990 prevzel Francis Collins
projekt Celera
hitro sekvenciranje celotnega genoma
1997 komercialno podjetje Celera pod vodstvom Craiga Ventera
človeški genom
*velikost 3,2 Gbp (3,2 x 109bp) *okoli 25.000 genov
cDNA knjižnjice
prepisi celične mRNA
*najprej se ekstrahira mRNA iz specifičnih organizmov ali celic tkiva *komplementarno verigo DNA (cDNA) se iz mRNA pripravi s pomočjo reverzne transkriptaze *nastali hibrid se obdela v alkalnem *komplementarni verigi DNA, DNA polimeraza ob uporabi ustreznih oligonukleodov dosintezira verigo *nastane stabilna dvojnovijačna DNA
primer sistema za izražanje rekombinantnih proteinov
*eden najučinkovitejših sistemov je sistem za izražanje, ki je pod kontrolo promotorja bakteriofaga T7 *kompabilen sev E. coli vsebuje v svojem genomu zapis za T7 RNA polimerazo, ki je pod kontrolo represorja lac–> indukcija z IPTG *detekcija izraženih proteinov z NaDS PAGE
afinitetno označevanje rekombinantnih proteinov
*za lažjo izolacijo rekombinantne proteine ponavadi označimo s specifičnimi oznakami (tag) *na N-ali C-konec uvedemo dodatna zaporedja, preko katerih protein očismo s pomočjo afinitetne kromatografije
vnos rekombinantne DNA v živalske celice
*endocitozni sprejem(rDNA se obori s kalcijevim fosfatom –učinkovitost vnosaintegracija s kromosomsko DNA je 1%) *elektroporacija(izpostavljenost električnem sunku –poveča se prepustnost celične membrane) *mikroinjeciranje(raztopino rDNA se neposredno vbrizga s stekleno mikropipeto (2 %) najučinkovitejši so retrovirusi
