purificacion de proteinas Flashcards
purificacion de una nueva proteina
se emplea la expriencia y el sentido comun
se emplea diferentes metodos secuenciales de forma epirica hasta encontrar la mejor forma
los metodos mas sofisticados y caros se reservan para el final
cromatografria
en papel
en capa fina
en columna
de intercambio ionico
de exclusion molecular
de afinidad
cromatografia liquida de alto rendimiento
cromatografia
tecnica para fraccionar mezclas organicas al desplazarla a traves de una matriz
metodo de separacion en el que se aprovechan las diferencias en el coeficiente de particion entre una fase movil y una fase estacionaria
cromatografia
coeficiente dee particion
es el coeciente entre las concentraciones de una sustancia en las dos fases formadas por dos disolventes inmiscibles en equilibrio
mide la solubilidad diferencial de una sustancia en esos dos disolventes
Un soporte (matriz) mantienen sostenida la fase
la fase estacionaria y la fase m6vil acarrea a la muestra.
Los componentes de la muestra que interaccionan fuertemente con la fase estacionaria
tendran un tiempo de retencion (desde la entrada hasta el detector/salida) mayor.
Retenci6n.
Efecto producido sobre los componentes
de la mezcla por una fase estacionaria, que puede ser un solido o un liquido anclado a un soporte solido.
Desplazamiento.
Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase movil (eluyente), que puede ser un liquido o un gas.
Elucion/eluir.
Migracion/migrar de los componentes de una
mezcla retenidos a lo largo de la fase estacionaria, impulsados por el desplazamiento ejercido por la fase m6vil.
Tipos de cromatograffa
Dependiendo de la naturaleza de las fases estacionaria y movil.
- Solido-liquido.
- liquido-liquido.
- liquido-gas.
- So1ido-gas. La fase estacionaria
Cromatografia
- En papel.
- Fase estacionaria: papel flltro.
- Version primitiva de la capa fina.
- Para aminoacldos individuales o dipeptidos.
- Empleada por Sanger en la secuenclaclon de la lnsulina.
- En capa fina.
Fase estacionarla: placa adsorbente, los mas usados silica gel y alumina, adherldo a un soporte de plastlco, vidrio o aluminio.
La fase estacionaria, se empaqueta en
una columna, evitando que el aire quede atrapado interrumpiendo la
continuidad de las fases.
Componentes que eluyen a diferentes velocidades podran ser
separados.
Cromatografia a en columna
Los componentes pueden ser colectados para su analisis posterior.
Cromatografia de intercambio ionico
Aprovecha las diferencias en signo y magnitud de las cargas que tienen las moleculas coma las proteinas a distintos pH.
- El mecanismo basico de la cromatografia de intercambio ionica
el intercambio reversible de las iones en solucion con los grupos funcionales cargados
unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina
lntercambio cationico (resina carga negativa).
- Fuerte. Acido sulfonico.
- Debil. Acido carboxilico.
- lntercambio anionico (resina carga positiva).
- Fuerte. Aminas cuaternarias.
- Debil. Aminas secundarias o terciarias.
Cromatografia de intercambio anionico
molecula con carga negativa se unira a un intercambiador ionico con grupos cargados positivamente, pero eluira de la columna al incrementar la concentracion de sales.
lntercambio ionico de peptidos
La separacion se optimiza cambiando gradualmente el pH y/o la concentracion de sales de la fase movil para crear un gradiente.
Moleculas con carga opuesta a la de la matriz a donde migraran en el intercambio ionico de peptidos
mas lentamente que aquellas con carga del mismo signo que la fase estacionaria.
Cromatografia de exclusion molecular
Separacion del soluto segun su tamano y estructura molecular.
q pasa con las moleculas pequeñas en la cromatografia de la exclusion molecular
entran en el laberinto de los espacios dentro
de la matriz y son retrasadas.
q pasa con las moleculas grandes en la cromatografia de la exclusion molecular
no entran dentro de las cavidades de la
matriz y atraviesan mas libremente
recuperandose en las primeras
fracciones.
las dlferentes fases m6viles pueden afectar al orden de elucion debido a
los cambios de tamaiio en disoluci6n (radio hidrodinamico o radio de giro).
Cromatografia de afinidad
Es la cromatografia de mayor especificidad y selectividad para la purificacion de biomoleculas.
