purificacion de proteinas Flashcards
purificacion de una nueva proteina
se emplea la expriencia y el sentido comun
se emplea diferentes metodos secuenciales de forma epirica hasta encontrar la mejor forma
los metodos mas sofisticados y caros se reservan para el final
cromatografria
en papel
en capa fina
en columna
de intercambio ionico
de exclusion molecular
de afinidad
cromatografia liquida de alto rendimiento
cromatografia
tecnica para fraccionar mezclas organicas al desplazarla a traves de una matriz
metodo de separacion en el que se aprovechan las diferencias en el coeficiente de particion entre una fase movil y una fase estacionaria
cromatografia
coeficiente dee particion
es el coeciente entre las concentraciones de una sustancia en las dos fases formadas por dos disolventes inmiscibles en equilibrio
mide la solubilidad diferencial de una sustancia en esos dos disolventes
Un soporte (matriz) mantienen sostenida la fase
la fase estacionaria y la fase m6vil acarrea a la muestra.
Los componentes de la muestra que interaccionan fuertemente con la fase estacionaria
tendran un tiempo de retencion (desde la entrada hasta el detector/salida) mayor.
Retenci6n.
Efecto producido sobre los componentes
de la mezcla por una fase estacionaria, que puede ser un solido o un liquido anclado a un soporte solido.
Desplazamiento.
Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase movil (eluyente), que puede ser un liquido o un gas.
Elucion/eluir.
Migracion/migrar de los componentes de una
mezcla retenidos a lo largo de la fase estacionaria, impulsados por el desplazamiento ejercido por la fase m6vil.
Tipos de cromatograffa
Dependiendo de la naturaleza de las fases estacionaria y movil.
- Solido-liquido.
- liquido-liquido.
- liquido-gas.
- So1ido-gas. La fase estacionaria
Cromatografia
- En papel.
- Fase estacionaria: papel flltro.
- Version primitiva de la capa fina.
- Para aminoacldos individuales o dipeptidos.
- Empleada por Sanger en la secuenclaclon de la lnsulina.
- En capa fina.
Fase estacionarla: placa adsorbente, los mas usados silica gel y alumina, adherldo a un soporte de plastlco, vidrio o aluminio.
La fase estacionaria, se empaqueta en
una columna, evitando que el aire quede atrapado interrumpiendo la
continuidad de las fases.
Componentes que eluyen a diferentes velocidades podran ser
separados.
Cromatografia a en columna
Los componentes pueden ser colectados para su analisis posterior.
Cromatografia de intercambio ionico
Aprovecha las diferencias en signo y magnitud de las cargas que tienen las moleculas coma las proteinas a distintos pH.
- El mecanismo basico de la cromatografia de intercambio ionica
el intercambio reversible de las iones en solucion con los grupos funcionales cargados
unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina
lntercambio cationico (resina carga negativa).
- Fuerte. Acido sulfonico.
- Debil. Acido carboxilico.
- lntercambio anionico (resina carga positiva).
- Fuerte. Aminas cuaternarias.
- Debil. Aminas secundarias o terciarias.
Cromatografia de intercambio anionico
molecula con carga negativa se unira a un intercambiador ionico con grupos cargados positivamente, pero eluira de la columna al incrementar la concentracion de sales.
lntercambio ionico de peptidos
La separacion se optimiza cambiando gradualmente el pH y/o la concentracion de sales de la fase movil para crear un gradiente.
Moleculas con carga opuesta a la de la matriz a donde migraran en el intercambio ionico de peptidos
mas lentamente que aquellas con carga del mismo signo que la fase estacionaria.
Cromatografia de exclusion molecular
Separacion del soluto segun su tamano y estructura molecular.
q pasa con las moleculas pequeñas en la cromatografia de la exclusion molecular
entran en el laberinto de los espacios dentro
de la matriz y son retrasadas.
q pasa con las moleculas grandes en la cromatografia de la exclusion molecular
no entran dentro de las cavidades de la
matriz y atraviesan mas libremente
recuperandose en las primeras
fracciones.
las dlferentes fases m6viles pueden afectar al orden de elucion debido a
los cambios de tamaiio en disoluci6n (radio hidrodinamico o radio de giro).
Cromatografia de afinidad
Es la cromatografia de mayor especificidad y selectividad para la purificacion de biomoleculas.
fases de la cromatografia de afinidad
- Se basa en la interacci6n especifica de dos moleculas
- Una de ellas se une covalentemente a la fase estacionaria
- moleculas que han quedado por su afinidad por la fase estacionaria se liberan por un cambio del medio eluyente
a condiciones en las que la interacci6n se
debilite:
- pH (lo que afecta al estado de ionizacion de las biomoleculas).
- Fuerza ionica
- Polaridad. (solubilidad).
- Solucion de las moleculas inmovilizadas.
Etiquetas terminales
- varias proteinas no se unen a un ligando
permitiendo su purificacion por afinidad. - Se expresa una proteina recombinante de fusion con un peptide que une con alta afinidad y especificidad a un ligando.
- La etiqueta se remueve despues con una proteasa que corta cerca de la union entre la proteina de interes y la etiqueta.
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)
*Cromatografia liquida de alto rendimiento.
liquido - liquido.
uso de bombas de alta presion para mover las moleculas a traves de la columna.
para analizar componentes no volatiles como tambien azucares, vitaminas, drogas y metabolitos.
HPLC analitica
Determinar la composicion de la mezcla.
HPLC Preparativa.
Se pueden recuperar los componentes posteriormente a su analisis para estudios posteriores
El area bajo la curva de cada pico es proporcional a
a la cantidad/concentraciOn de cada componente en la mezcla analizada.
Electroforesis
fundamentales para aislar y purificar macromoleculas en base a su movilidad dentro de un soporte o matriZ solida en un campo electrico.
EN LA ELECTROFORESIS PUEDEN SER ANALIZADOS
ACIDOS NUCLEICOS Y PROTEINAS
Electroforesis en gel
El medio de soporte solido es un gel.
geles en la electroforesis
geles de agarosa y geles de poliacrilamida
Geles de poliacrilamida.
Analisis principalmente de muestras de
proteinas, aunque tambien para acidos nucleicos es posible en caso de que se requiera mayor resoluci6n que la que brinda la agarosa.
Geles de agarosa.
Analisis de muestras de acidos nucleicos. En agarosa no pueden ser observadas difeerencias pequeñas en pesos moleculares de las moleculas analizadas.
Movilidad electroforetica
movilidad de la molecula esta en funci6n de su
peso molecular y su carga electrica
las diferentes movilidades que exhiben las diferentes macromoleculas las que permiten su separacion.
Las moleculas siempre se mueven hacia el
el electrodo de polaridad opuesta a la carga neta de la molecula los cationes se mueven hacia el catodo y los aniones hacia el anodo).
Factores intrinsecos de la molecula.
- Carga electrica.
- Peso molecular.
Factores extrinsecos a la molecula.
- Concentracion del gel (agarosa principalmente).
- Voltaje aplicado.
- Tiempo de corrida.
- Temperatura.
Factores intrinsecos de la molecula.
- Relacion carga electrica/peso molecular.
- A mayor relacion carga electrica/peso molecular, mayor movilidad
- Proteinas: esta relacion no es constante.
- Acidos nucleicos: esta relacion es constante.
Si la relacion carga electrica/peso molecular es
constante, la movilidad «queda
«queda en funcion del peso molecular», si este se incrementa la movilidad disminuye y viceversa.
Movilidad electroforetica en gel
En base al peso molecular de la macromolecula.
Electroforesis de protef nas en gel
- Electroforesis en 1 Dimension (PAGE).
- Electroforesis en 2 Dimensiones (2D).
niveles de organizacion de las proteinas
- AA
- interactuan con enlaces de hidrogeno
3.atracciones entre helices alfa y hojas plegadas - mas de una cadena de aa
Geles de poliacrilamida
- Acrilamida
Formacion de polfmeros. - bisacrilamida
Entrecruzamiento entre las cadenas de polimeros.
Las proteinas no tienen una relacion carga electrica/peso molecular constante.
2. La forma de la protelna influye en la movilidad presentan mayor movilidad.
* Por lo tanto si las proteinas se analizan asi nada mas, se obtiene un fraccionamiento q no obedece a la diferencia del peo molecular
Emplear SOS en la preparacion del gel de poliacrilamida.
El corrimiento electroforetico observado puede representar a mas de una cadena polipeptfdica.
Emplear agentes desnaturalizantes reductores.
SDS sobre la relacion carga electrica/peso molecular.
Se une a las zonas apolares del polipeptido.
SDS sobre la estructura proteica.
Agente desnaturalizante.
la repulsion electrostatica por la union del SDS rompe los enlaces no covalentes hacienda que la proteina pierda su conformacion.
Se eliminan las diferencias en conformacion y su influencia sobre la movilidad de las diferentes proteinas que han de ser
separadas en el gel.
las cisteinas en las proteinas pueden formar
enlaces puentes de disulfuro.
Puentes disulfuro en las protef nas
Ayudan a estabilizar estructuras terciarias y cuaternarias y mantienen cierto plegamiento en las proteinas
Ditiotreitol (DTT) o P-Mercaptoetanol.
Agentes desnaturalizantes reductor.
Se puede determinar el numero y
tamaño de subunidades proteicas
comparando
la electroforesis bajo condiciones reductoras y no reductoras.
Azul de Bromofenol
Se adiciona al buffer de carga de la muestra.
Permite visualizar el corrimiento electroforetico.
* Carga negativa por encima de pH 4.6.
* Peso molecular menor que cualquier proteina.
Protelnas con diferentes pesos
moleculares poseen diferente
Relacl6n de Frente (RF).
Revelado del gel. Metodos de Tinci6n
azul d coomassie y tincion de plata
Azul de Coomassle
Puede detectar bandas de hasta SO ng.
Tincion de plata.
lncrementa la senslbilidad de deteccl6n
Electroforesis en 2 Dimensiones
1 Dimension.
- Separacion por punto isoelectrico.
2da. Dimension.
- Separacion por tamaño.
Punta isoelectrico
Es el pH al que un polianfolito tiene carga neta cero.
Los polianfolitos son
moleculas grandes como las proteinas
que tienen muchos grupos acidos o basicos
molecula con un Pl bajo tendra
grupos acidicos
pl alto
grupos basicos.
Proteinas expresadas en dos tejidos humanos
Las diferencias entre las dos muestras de tejido superan sus similitudes: incluso para proteinas que se comparten entre los dos tejidos, sus abundancias relativas son
generalmente diferentes.
