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Biotecnología vegetal > Protoplastos vegetales > Flashcards

Protoplastos vegetales Flashcards

1
Q

¿Qué es un protoplasto vegetal?

A

Células que han sido separadas de sus paredes vegetales mecánica o enzimáticamente y que deja solamente el contenido celular rodeado por el plasmalema

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2
Q

¿De dónde se pueden aislarlos protoplastos?

A

Plantas completas o material cultivado in vitro

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3
Q

¿Qué plantas se han conseguido generar a partir de protoplastos?

A

Solanáceas (tabaco, tomate, patata), crucíferas, leguminosas forrajeras y algunas Umbelíferas

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4
Q

¿Qué ventajas y desventajas presenta el uso de material in vitro?

A

No precisa esterilización pero es genéticamente inestable y los protoplastos resultantes pueden presentar un elevado grado de heterogeneidad

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5
Q

¿Qué es el tratamiento preplasmolizante?

A

Introducción en un medio ligeramente hipertónico para ocasionar la contracción delos citoplasmas y el cierre de los plasmodesmos, para reducir la enzima incorporada al interior y la salida de contenido

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6
Q

¿Cómo es el aislamiento en un mesófilo de hoja?

A

Se esteriliza la hoja con hipoclorito cálcico 10 minutos. Se lava 3 veces 5 minutos en agua destilada estéril y se separa la epidermis inferior o se obtienen cortes muy delgados.

Tratamiento preplasmolizante con sales del medio y un agente osmótico (manitol o sorbitol), durante una hora antes de la incubación enzimática. A veces se añade L-arginina y L-lisina al medio de incubación,

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7
Q

¿Para qué se puede añadir L-arginina y L-lisina?

A

Reduce la senescencia de los protoplastos y estimula la síntesis de macromoléculas que aumentan su viabilidad

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8
Q

¿En qué condiciones osmóticas hay que aislar los protoplastos?

A

En un medio isotónico, para lo cual se usan soluciones de azúcar, sorbitol o propilenglicol

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9
Q

¿Qué desventaja presenta utilizar azúcar para establecer el potencial osmótico?

A

No es capaz de mantenerla mucho tiempo

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10
Q

¿Que hay que hacer con callos o células en suspensión cuando queremos aislar material?

A

Es conveniente subcultivarlo cada 3-8 días

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11
Q

¿Por qué hay que subcultivar frecuentemente los callos o células en suspensión?

A

Para que este sea lo más joven posible y se encuentre en fase exponencial donde la pared es más delgada

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12
Q

¿Qué otro material puede utilizarse para el aislamiento de protoplastos?

A

Ápices de tallo, plántulas obtenidas in vitro, cotiledones o hipocotilos. Se procede como en el caso del mesófilo de la hoja.

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13
Q

¿Con qué métodos ponemos obtener los protoplastos?

A

Método secuencial y método en un solo paso (enzimáticos); y método quirúrgico

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14
Q

¿Qué caracteriza al método secuencial?

A

Se obtienen protoplastos separados y uninucleados, es más riguroso

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15
Q

¿Cómo se realiza el método secuencial?

A
  1. Se utiliza pectinasa (macero-enzima R-10) que degrada la laminilla media y las pectinas de la pared
  2. Tratan con mezcla celulasa y hemicelulasa que hidrolizan las paredes y liberan los protoplastos
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16
Q

¿Qué caracteriza al método en un solo paso?

A

Se obtienen protoplastos multinucleados, es menos laborioso

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17
Q

¿Cómo se realiza el método en un solo paso?

A

Se utiliza una mezcla de enzimas con pectinasas y celulasas

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18
Q

¿Cómo se realiza el método quirúrgico?

A

Laboriosa manipulación con microagujas cuando es necesario evitar efectos indeseables de las enzimas

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19
Q

¿Cómo se purifican los protoplastos?

A

Mediante filtrado (retirando restos con tamices), centrifugado (retirando el sobrenadante), resuspensión y lavado en un medio salino

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20
Q

¿Cómo se cultivan los protoplastos?

A

Se pueden cultivar en medio líquido o semisólido. Otros métodos sofisticados con las microcámaras y la cámara de Maximov’s.

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21
Q

¿Cómo es el cultivo en medio líquido de protoplastos?

A

En placas de Petri con una alta densidad de protoplastos suspendidos.

  • Cajas cerradas con parafilm para evitar la pérdida de agua y capas poco profundas para adecuada provisión de O2
  • Pueden emplearse microcámaras
22
Q

¿Cómo es el cultivo en medio semisólido de protoplastos?

A

Mezclar suspensión de protoplastos al doble de la densidad requerida con volumen igual de agar fundido a 43-45ºC.
- La [agar] es la requerida para obtener un gel blando

23
Q

¿Para qué es apropiado cada tipo de medio de cultivo?

A

Medio líquido –> hibridaciones

Medio semisólido –> selección tipos celulares (formarán colonias resistentes)

24
Q

¿Cuál es la composición del medio de cultivo para protoplastos?

A
  • Altas cantidades de nitrógeno (nitratos+a.a.)
  • Sacarosa o glucosa 2-3%
  • Ca y microelementos en una % adecuada
  • Ácidos orgánicos mejoran la viabilidad y crecimiento de protoplastos (cítrico, málico y fumárico)
  • 1 o más auxinas y 1 o más citoquininas (pocas veces no es necesario), se puede aádir giberelinas y vitaminas
  • Sulfato de adenina
25
Q

¿Cómo se procede cuando los protoplastos inician la división?

A

Se aumenta la proporción auxina/citoquinina y se adiciona ácido giberélico y vitaminas para favorecer morfogénesis

26
Q

¿Para qué se utiliza la giberelina?

A

Estimula la morfogénesis en protoplastos

27
Q

¿Qué factores físico-químicos precisan los protoplastos?

A
  • Se inician en oscuridad o luz débil y se aumenta posteriormente
  • Temperaturas 10-28 ºC (plantas climas más cálidos funcionan bien a temperaturas + altas)
  • pH 5.5-5.9
28
Q

¿Por qué es importante la luz en cultivo protoplastos?

A

Es un factor clave al ser necesaria para la división del protoplasto y la inducción de la polaridad

29
Q

¿Por qué razones el proceso de plasmólisis y aislamiento es estresante para la célula?

A
  • Pérdida información posicional
  • Ruptura de la comunicación intercelular vía plasmodesmos
  • Alteración de la estructura del citoesqueleto
  • Cambios en el suministro de nutrientes
  • Alteración del volumen y área superficial
30
Q

¿Qué ocurre con las corrientes citoplasmáticas?

A

Cesan durante las 24 horas después del aislamiento debido al estrés

31
Q

¿Por qué es necesario determinar la viabilidad de los protoplastos?

A

Evaluar bondad de la técnica de aislamiento y conocer el estado del cultivo

32
Q

¿Con qué métodos determinamos la viabilidad de los protoplastos?

A
  1. Diacetato de fluoresceína y citometría de flujo
  2. Rojo neutro
  3. Azul de Evans y fenolsafranina
  4. Azul de metileno
  5. Existencia de ciclosis
33
Q

¿Qué fundamento tiene el uso de tinciones para determinar la viabilidad?

A

Rojo neutro –> tiñe metabólicamente activos
Azul de Evans y fenolsafranina –> rotos y muertos
Azul de metileno –> amarillo claro (suficiente poder reductor) o color azul (muertos)

34
Q

¿En qué se basa la técnica del diacetato de fluoresceína?

A

Si un protoplasto tiene actividad esterasa separara al acetato de la fluoresceína, quedando libre y pudiendo ser detectada

35
Q

¿Qué ventajas poseen los protoplastos como sistema experimental?

A
  1. Modificación genética (sin pared)
  2. Hibridación somática
  3. Estudio de membrana (plasmalema expuesto)
  4. Clonación de líneas
  5. Captación y transporte de nutrientes
  6. Obtención de preparados de vacuolas y otros orgánulos celulares (tejidos vegetales con gran cantidad de celulosa, lignina…)
36
Q

¿Qué es la hibridación somática?

A

Fusión de 2 protoplastos, espontánea o inducida con fusógenos, antes de que desarrollen una nueva pared (sean o no de la misma especie –> homocariontes o heterocariontes)

37
Q

¿En qué basan su acción los fusógenos?

A

Son agentes químicos o físicos dirigidos a eliminar las cargas negativas de la superficie del protoplasto

38
Q

¿Cuáles son los principales fusógenos químicos?

A

Tratamientos con NO3Na, medios con Ca²⁺ a pH 9.5, polietilenglicol y otros polímeros hidrosolubles alcohol (polivinílico, dextrano, gelatina y lecitina)

39
Q

¿Qué caracteriza los tratamientos con NO3Na?

A

Son poco usados (aunque fueron los 1º en usarse). Da una baja frecuencia de heterocariontes especialmente cuando son protoplastos de mesófilo altamente vacuolado

40
Q

¿Qué caracteriza el uso de polietilenglicol?

A

Es el fusógeno químico más utilizado.

  • Elevada estabilidad y facilidad de manipulación
  • Soluciones de PGE al 25-30%
  • Frecuencia obtenida del 10-40%
41
Q

¿En qué se basa la electrofusión ?

A

Al efecto de la dielectroforesis. Se aplica un campo eléctrico alternante a la suspensión de protoplastos, se polariza su carga superficial y migran al polo formando collares de perlas.

Posteriormente se aplican 1 o 2 pulsos de corriente de alta intensidad y corta duración. Ocasiona la degradación de las membranas celulares y su fusión.

  • Frecuencias del 60-80% sin las condiciones fisiológicas negativas del PGE o el elevado pH
42
Q

¿Cuáles son los métodos de selección de híbridos somáticos?

A
  1. Aislamiento directo
  2. Método visual
  3. Citometría de flujo
  4. Basado en características físicas
  5. Complementación genética en los híbridos
  6. Selección por heterosis
  7. Uso de inhibidores metabólicos
43
Q

¿Qué peculiaridades tiene el aislamiento directo?

A

Se utiliza cuando se emplea micro electrofusión. Se aísla con una micropipeta o micromanipulador. Es más complicado el cultivo posterior ya que se emplea el método nodriza o cultivo en microgota.

44
Q

¿En base a qué características físicas podemos separar heterocariontes?

A

Distinguir carga eléctrica del híbrido y cada uno de los participantes o centrifugación diferencial

45
Q

¿En qué se basa la selección por heterosis?

A

Los heterocariontes presentan vigor híbrido y crecen más rápidos

46
Q

¿En qué se basa el uso de inhibidores metabólicos?

A

Una de las líneas parentales se trata con un inhibidor bioquímico irreversible como iodoacetato dietilpirocarbamato

47
Q

¿Qué es un cíbrido?

A

Híbrido asimétrico cromosoma 1 de las especies +orgánulos mezclados

48
Q

¿Qué aplicaciones tienen las fusión de protoplastos?

A
  1. Crear híbridos que no serían posibles con cruzamientos normales
  2. Transferencia parcial de genoma
  3. Híbridos a partir de plantas subletales con órganos sexuales anormales o con esterilidad masculina completa
  4. Hibridación entre plantas juveniles o leñosas donde hibridación sexual requiere de mucho tiempo
  5. Cibridación.
  6. Introgresión de genes silvestres en las especies cultivadas (transferencia de resistencia a triazinas de especie silvestre resistente a cultivada sensible)
  7. Transferencia de caracteres sin necesidad de conocimiento detallado del genoma y sus mecanismos. Ventaja frente a ingeniería genética.
  8. Transferencia de genes de herencia cuantitativa.
49
Q

¿De qué manera podríamos transferir características codificadas en el cromosoma mitocondrial?

A

Produciendo cíbridos que contuvieran los mitocondrias de una línea y los cromosomas de otra

50
Q

¿Qué desventajas presenta la hibridación somática?

A
  1. Carencia de sistema de selección eficaz de protoplastos fusionados.
  2. Aparición de híbridos desequilibrados
  3. Desarrollo de callos con quimeras (especialmente cuando no hay fusión de protoplastos)
  4. Producción de híbridos muy variables
51
Q

¿A consecuencia de que los híbridos pueden ser muy variables?

A
  • Formación de aneuploides en hibridaciones de especies alejadas taxonómicamente (generalmente se retiene cromosomas del parental con el ciclo celular más corto)
  • Translocaciones cromosómicas
  • Incidencia de variación somaclonal
  • Segregación de orgánulos (tras fusión hay eliminación de plastidios y recombinación de mitocondrias)

Biotecnología vegetal (12 decks)

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