Protéines Recombinantes Flashcards
À quel endroit de la cellule les protéines recombinante agissent-elles?
À l’extérieur de la cellules
À quel niveau les protéines recombinantes agissent-elles?
- Ligand
- Anticorps neutralisant
- Anticorps qui empêche l’hétérodimérisation des récepteurs
- Anticorps qui empêche l’activation des récepteurs tyrosine kinase
Les régions codantes dérivent de quoi?
Plusieurs milliers de gènes clonés
Qu’est-ce que l’adalimumab?
Un anticorps intégralement humain neutralisant le TNF-Alpha
Pourquoi développer des protéines recombinantes?
Les produits dérivés des animaux provoquent des réactions immunitaires
Quelles sont les avantages des protéines recombinantes?
- Production à grande échelle
- Propriétés uniques (anticorps)
Quel est le principe de l’ADN recombinant?
Un fragment ADN d’intérêt isolé à partir d’un organisme est cloné dans un vecteur (fragment d’ADN capable de réplication autonome et de lire l’information du transgène).
Quelles sont les polymérase qui nous permettent de se servie de l’ARN comme matrice?
Les réverses transcriptases
Les réverses transcriptases sont disponibles commercialement sous quelles formes recombinantes?
AMV et MuLV
Comment définit-on la protéine recombinante?
Les protéines recombinantes sont ainsi qualifiées dans la mesure où elles sont produites par des cellules dont l’ADN a été modifié (recombiné) par recombinaison génétique.
Qu’elles sont les éléments nécessaires à la production d’une protéine recombinante?
1- L’emploi d’un vecteur d’expression (transporteur génétique d’un gène d’intérêt codant pour la protéine recherchée
2- l’utilisation d’une cellule hôte
3- Une phase de production
4 - Séparation et extraction de la protéine du milieu de culture et une purification de celle-ci
Quelles sont les grandes lignes de la production d’une protéine recombinante?
• Identification de la source (tissu/cellules) responsable de la production du biologique (la protéine recombinante)
• Trouver la séquence ARNm (Blue print)
• Design oligonucléotides; RT-PCR (production d’ADNc); PCR (amplification de l’ADNc sous forme double-brin (ds-ADNc) et prêt au clonage);
• Clonage de l’ADNc dans un vecteur d’expression choisi et séquençage (on veut que cette recombinaison génétique entre l’insert et le vecteur produise une construction plasmidique permettant la production d’une protéine fonctionnelle)
• Amplification construction plasmidique
• Insertion de la construction dans l’hôte (transformation/transfection)
• Production de la protéine par l’hôte
• Purification de la protéine recombinante
Quels sont les inconvénient de la production de l’insuline recombinante?
- Coute cher pour un rendement faible
- Allergies
-Virus
Quelles est le processus naturel de biosynthèse de l’insuline (préproinsuline à insuline)?
1- Production de la préproinsuline au niveau du RE
2- Oxydations des résidus cystéines et clivage par protéases
3- Stockage de l’insuline dans des vésicules de sécrétions dans des cellules spécialisées du pancréas
Où sont présentes les protéines et les ARNm de l’insuline?
Les cellules beta (îlots de Langerhans) du pancréas
D’où provient l’hormone de croissance?
L’Hypophyse
Quelle est le rôle de l’hormone de croissance?
Régule la croissance et le développement
Les hormones de croissances purifiées à partir d’animaux sont elles efficaces chez l’homme?
Non, contrairement à l’insuline recombinante
Quelles sont les 2 procédés qui permettent de produire l’hormone de croissance humaine dans les bactéries?
Forme non-sécrétée
Forme sécrété
Quel est le role des interférons de type I et type II?
Cytokines avec des effets paracrines et autocrines modulant les réponses immunitaires innées et adaptatives
Quelle est la source des interférons?
Leucocytes
Quelles sont les 2 techniques qu’on peut utiliser pour amplifier les IFN?
- ARN de leucocytes
- Banques d’ADNc
Quelles est la définition d’une banque d’ADNc?
La banque d’ADNc (cDNA library) est donc une collection de clones (copies) d’ADNc représentant toutes les molécules d’ARNm présentes dans une préparation particulière obtenue à partir de cellules ou d’un tissu biologique donné. Elle représente donc le transcriptome de ce tissu.
Quelles sont les étapes de production de IFN recombinant?
• Banque d’ADNc dérivée de leucocytes
• Design d’amorces visant à amplifier l’IFNbeta (exemple)
• PCR (pas besoin de faire une RT-PCR ici!)
• Sous-clonage de l’amplicon (produit de PCR) dans un vecteur d’expression
pour les procaryotes, maxi-prep et séquençage
• Sélection d’une colonie sur pétri agar
• Repiquage de la colonie et culture en milieu liquide (phase de production)
• Extraction et purification
Le gène HBsAg a été cloner dans un vecteur d’expression de la levure. La transcription s’effectue à partir d’un promoteur fort du gène qui code pour quoi?
L’alcool deshydrogénase I
Les Ugg sont sécrété par quelles cellules?
Les lymphocytes B
Quelle partie de l’anticorps va lier l’antigène?
La portion variable
Les domaines constants de l’anticorps interviennent dans quoi?
Dans l’activation du système du complément
Combien de molécules d’antigènes un anticorps peut-il lier?
2 sites de liaison (1 chaque bras) destiné à différents épitopes (les 2 sites sont identiques)
La multitude de récepteur antigéniques est produire par quel processus?
La sélection clonale
Quelle est la caractéristique commune du fragment Fv et du fragment Fab d’un anticorps?
Ils sont monovalent
Qu’est ce que le complément?
Il s’agit d’un ensemble de protéines du plasma dont l’activation (par la voie classique dans le cas d’anticorps) permet de détruire des bactéries ou cellules cancéreuses par perforation et de faciliter la phagocytose, l’élimination des complexes immuns et la libération de molécules chimiotactiques. Ce qui amène à la lyse de la cellule. Ces protéines sériques sont des médiateurs de l’inflammation.
Qu’est-ce que le paratope?
régions déterminant la complémentarité
Qu’est-ce qu’un anticorps polyclonal?
Un mélange d’anticorps reconnaissant différents épitopes sur un antigène donné, chaque idiotype étant sécrété par un clone de plasmocytes différent.
Qu’est-ce qu’un anticorps monoclonal?
Ne reconnaissent chacun qu’un seul épitope de cette molécule
Qu’est-ce que Rituximab?
Ac monoclonal chimérique contre la protéine de surface des lymphocytes B, CD20. Suivant l’opsonisation des lymp B par cet Ac, ces derniers sont éliminés par le système immunitaire. Utilisé pour le traitement des lymphomes non-hodgkiniens (cellules T et B).
Quelles est la principales limitation de l’utilisation thérapeutiques des AC?
production d’AC d’intérêt en grande quantité
Quelle est la technologie des hybridons?
1) L’antigène est injecté chez la souris, et des cellules de rate en sont prélevées après quelques semaines. Dans ces cellules se trouvent des plasmocytes sécrétant des anticorps dirigés spécifiquement contre l’antigène choisi.
2) Ces plasmocytes sont alors fusionnés in vitro avec des myélomes (qui sont des cellules B tumorales ayant la
propriété de se multiplier indéfiniment et ne produisant pas d’IgG (modifiées)) par traitement au polyéthylène glycol.
3) Les cellules hybrides obtenues (dites « hybridomes ») sont sélectionnées par culture sur un milieu HAT (page suivante) puis multipliées dans un milieu de culture approprié.
4) Une dilution dite clonale permet l’expansion de clones, chacun produisant un IgG (Ac) particulier.
5) Les Ac sécrétés sont testés contre l’Ag (ex. ELISA)
6) Le clone positif produisant les anticorps monoclonaux est
amplifié puis congelé,
7) Ce stock d’hybridome permettra de produire au besoin des
Ac très purs et en quantités importantes.
Comment appelle-t-on le premier brin qui est synthétiser Par la réverse transcriptase?
Brins d’ADNc néosynthétisé monocaténaire
Quelle est la définition d’ADN recombinant?
ADN recombinant: ADN biologiquement actif (ADNc) qui a été constituée in vitro à partir de segments d’ADN issus de différentes sources (dans notre cas, les différents segments d’ADN sont: le plasmide et l’ADNc de la chaine b de l’insuline).
Qu’est-ce qu’un plasmide?
Petite molécule d’ADN circulaire retrouvée chez les bactéries (Escherichia coli) qui se réplique de façon indépendante du génome bactérien.
Quels sont les hôtes les plus utilisé pour la production de protéines recombinantes ?
Escherichia coli , la levure Saccharomyces cerevisiae et les cellules CHO extraites des ovaires de hamster
Quels sont les avantages de E.Coli?
- Génétique très bien connues
- Se prête très bien à la culture de masse en fermenteur
- Produit des quantité appréciables de protéines (jusqu’à plusieurs gramme par litre)
Quels sont les principaux inconvénients de E. Coli?
- Formation de corps d’inclusion (protéines inactive)
- Faibles sécrétions de protéines recombinantes : on doit casser la bactérie pour récupérer la protéine, ce qui peut affecter le rendement
- Pas de modifications post-traductionnelle
- Entérobactérie : on doit s’assurer de l’absence d’endotoxines dans les protéines purifiées
Quels sont les principaux avantages de Saccharomyces cerevisiae?
- Matériel génétique simple
- Aucune toxicité
- Taux d’expression des protéines relativement bon (centaine de mg par L)
- Capable de fabriquer des protéines plus complexes et de réaliser des modifications post-traductionnelle
Quels sont les principaux inconvénients de Saccharomyces cerevisiae?
- Protéines synthétisés se trouvent dans le cytoplasme : on doit casser la cellule pour les récupérer. La sécrétion est possible mais au détriment du rendement (fonctionne mal pour les protéines complexes et de grande taille)
Quelles sont les avantages des cellules CHO?
- Se prêtent bien à la culture de masse en bioréacteur
- Capable de synthétiser des protéines complexe et de poids moléculaire élevé (fait des modification post-traductionnelles)
Quelles sont les principaux inconvénients des cellules CHO?
- Rendement faible (10 mg par L)
- Cellules fragile et leur culture est plus onéreuse
- Hétérogénéité des CHO d’une compagnie à l’autre
Les cellules myélomateurse utilise pour la fusion dans la technologie des hybridome perdent la faculté de produire quelle enzyme?
hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT)
Quelles est le rôle de HGPRT?
Cette enzyme est impliquée dans la synthèse des nucléotides , plus particulièrement dans la voie de sauvetage
Quelles est le role de l’aminoptérine dans la technologie des hybridomes?
Agit en bloquant la synthèse de novo des nucléotides, ce qui oblige les hybridomes à utiliser la voie de sauvetage (bloqueur de la voie de novo de la synthèse des nucléotides)
Quels sont les substrats de la voie de sauvetage dans la technologie des hybridomes?
L’hypoxanthine et la thymidine
Quelles sont les caractéristique des plasmocytes?
-capacité limite de réplication (sénescence réplicative) -produisent des IgG
-utilisent la voie de novo et de sauvetage des nucléotide
Quelles sont les caractéristiques des myélomes?
-Immortelles (transformées)
-ne peuvent produire des IgG
-utilisent la voie de novo de synthèse des nucléotides (ne peuvent utiliser la voie de sauvetage)
Quelles sont les carcatéristiques des hybridomes?
- Immortelles (transformés)
- Produisent des IgG
- Utilisent la voie de novo et de sauvetage des nucléotides
Quelles cellules peuvent emprunter la voie de sauvetage des nucléotides?
Les hybridomes et les plasmocytes. Ces derniers ne pouvant proliférer représenteront une infime proportion de la population cellulaire et finiront par mourir.
Quel est le principe pour produire un Ac chimérique ?
Principe: effectuer des RT-PCR avec les ARNm isolés à partir de lymphocytes B humain afin d’amplifier les régions constantes des chaînes lourdes et légères. Sous-clonage de ces produits de PCR (amplicons) dans des vecteurs d’expression
Quelles sont les étapes à faire pour obtenir la partie variable d’un anticorps chimérique?
-Isolation des ARNm de l’hybribome positif (voir diapo #102)
-banque d’ADNc (banque d’expression)
-Séquençage de la partie variable des cDNA encodant pour les chaînes lourdes et légères avec l’utilisation d’une amorces complémentaires à la région constante chez souris (infos diapos
-design amorces pour PCR: amplification région variable
- Région variable amplifiée sous forme de cDNA à partir des infos de l’hybridome et prêt à sous-cloner « en phase » avec les cDNA codants pour les régions constantes humaines
Quels sont les problématiques associés à la production d’ACs monoclonaux humains?
1- Les chromosomes humains sont instables lors de la formation de l’hybridome
2- À ce jour, il n’existe pas de lignées humaines de myélome capables de remplacer la lignées de myélomes de souris
3- Considération éthique : injections d’un ag à un humain pour production d’AC
Qu’est-ce qu’une xénosouris?
Souris qui est génétiquement modifié pour ne plus encodé pour ses propres immunoglobulines. Elle produisent des immunoglobulines humaines, leur système immunitaire a été inactivé pour ne pas qu’elles fassent de réactions (immunodéficiente)
Quel est le premier AC monoclonal humaine qui a été approuvé pour le traitement de certaines formes de cancers colorectaux?
Panitumumab
Quelles sont les faiblesses de la techniques des hybridome?
-faible taux de croissance des hybridomes
-ne se cultive pas à haute densité
-requière des milieux de culture coûteux
Quelles sont les différentes approches de purification?
-chromatographie d’affinité;
-immunopurification;
-immunoprécipitation
-chromatographie d’échange d’ions
-chromatographie d’exclusion
-chromatographie de partages (en phase directe ou inverse)
Quelles est la définition d’un clone?
-clone: copie conforme d’un fragment d’ADN, d’une cellule ou d’un organisme (jumeaux).
Qu’est-ce qu’un clonage ?
Le terme clonage est utilisé par les biologistes afin de décrire des formes d’amplifications et de copiages de morceaux d’ADN à partir de la source originale et son introduction dans un vecteur (plasmide)
Qu’est-ce qu’un sous-clonage?
transfert d’une insertion d’ADN cloné ou une partie de ce dernier d’un vecteur à un autre vecteur.
Qu’est-ce que les oligonucléotides ou les amorces?
polymères d’acides nucléiques synthétiques
(de 6 à 100 mers) servant d’amorces pour les PCR ou de sondes pour l’hybridation.
Qu’est-ce que la transfection?
processus par lequel des plasmides sont incorporés dans des cellules eucaryotes.
Qu’est-ce que la transformation?
processus par lequel des plasmides sont incorporés dans les cellules procaryotes.
