ADN Recombinant 1 Et 2 Flashcards
De quoi se compose l’ADN recombinant?
Un fragment d’ADN et un vecteur
Quelle est la définition d’un vecteur?
Un vecteur est un ‘’véhicule’’ qui servira à l’entreposage d’un matériel génétique d’intérêt. Il peut également servir à introduire du matériel génétique dans une cellule ou un organisme, et à permettre son expression.
Quelles sont les différentes qualités d’un vecteur?
- Il peut contenir l’ADN d’intérêt
-Il peut se multiplier de manière autonome, ce qui permet d’amplifier l’ADN cloné. - Il permet la sélection de clones d’ADN
-Il peut présenter différentes composantes selon les fonctions requises
Quels sont les caractéristiques des plasmides de première génération?
Ceux retrouvés dans la nature. N’ont pas un grand nombre de sites de restrictions, ne possède pas nécessairement un gène de résistance ni un promoteur qui facilite l’expression du gène inséré
Qu’est-ce qu’un plasmide de 2e génération?
Les plasmides de 2e génération sont issus de plusieurs plasmides naturels, à partir desquels on a récupéré des éléments (origines de réplication, résistance) pour produire des plasmides recombinants utiles et faciles d’utilisation.
Qu’est-ce qu’un plasmide?
Un plasmide est une molécule d’ ADNdb circulaire qui mène une existence indépendante dans une bactérie
De quoi se compose un plasmide que l’ont retrouve dans la nature?
o Un ou plusieurs gènes qui ont souvent une caractéristique utile dans l’hôte (survie en conditions hostiles)
o Une séquence qui permet sa réplication (origine de réplication)
Quels sont les éléments d’intérêts dans un plasmides?
- ADN double brin circulaire
- Gènes de résistance
- Origines de réplication (Ori)
Quelles sont les caractéristiques d’un plasmide fertilité?
Contient les gènes tra qui permettent le transfert de plasmides par conjugaison (pilli sexuels)
Quelles sont les caractéristiques d’un plasmide de résistance?
Contient un gène qui promeut la résistance à un agent antibactérien
Quelles sont les caractéristiques des plasmides col?
contient un gène encodant pour les colicines, des protéines toxines (bactériocines) qui tuent les bactéries par différents mécanismes
Quels sont les caractéristiques des plasmides de dégradation?
contient des gènes permettant le métabolisme de substances comme le toluène et l’acide salicylique
Quels sont les caractéristiques des plasmides de virulence?
Confère une pathogénicité
Quelles sont les composantes du plasmide pBR322
- Gène de résistance aux antibiotiques ampicilline
- Gène de résistance aux antibiotiques tétracycline
- Promoteurs (qui précèdes les gènes de résistances)
- Séquence de Shine-Dalgarno : liaison d’un ribosome
- Sites de restrictions
- Origines de réplications
Quelles sont les éléments du plasmides pUC19 qui font en sorte qu’il a un mode de clonage et de sélection différentes du pBR322?
- Sites de clonages multiples
- gène de la beta galactosidase et possibilité de contrôle de son expression
Quels sont les caractéristique des plasmides d’expression moderne?
1- Site de clonage multiple qui fait preuve d’utilisabilité
2- Présence d’un TAG
3- Présence d’u promoteur
4- 1 ou plusieurs gènes de résistance aux antibiotiques
5- Différentes origine de réplication
Qu’est-ce qu’un TAG?
Un tag est une séquence en nucléotide qui sera transcrite en même temps que le gène d’intérêt pour produire une
protéine chimérique. Ce tag est utile pour la détection ou l’isolation de la protéine une fois synthétisée.
Quelles sont les différentes fonctions des plasmides?
- Vecteur de clonage : pour entreposer des fragments d’ADN
- Vecteur d’Expression : pour exprimer un gène
- Vecteur rapporteur : pour suivre l’induction d’un gène qui possède une activité enzymatique ou est fluorescent
Qu’est-ce qu’un bactériophage ?
Virus qui infecte une bactérie
Qu’elle est le role des séquence COS?
Elles permettent la circulation du génome viral lorsque
relâché dans la bactérie. Elles permettent aussi l’intégration du génome dans la capside de néo-virions
De quoi se compose le génome virale des bactériophages?
- Contient l’information génétiques des composantes des virions, des enzyme ou de la terminase
- Séquence COS
- Locus att
Qu’est-ce que le locus att?
Là ou le génome viral s’intègre dans le génome bactérien
Qu’est-ce que le cycle lytique?
Réplication et lyse de l’hôte
Qu’est-ce que le cycle lysogénique?
Intégration du génome de l’hôte
Qu’est-ce que les plasmides chimériques?
Il s’agit de plasmides hybrides qui contiennent des séquences provenant de bactériophages
Quels sont les particularités des plasmides chimériques?
Peuvent contenir de plus grands fragments que les plasmides et peuvent être encapsulé dans des phages
À quel endroit le fragment d’ADN est intégré dans un plasmide chimérique?
Entre 2 sites COS
Quel est le role des exonucléases?
Enlèvent 1 nt à la fois à partir d’une extrémité d’une molécule d’acide nucléique. Enlèvent des nt d’un brin seulement ou des 2 brins.
Quel est le role des endonucléases?
Coupent des liens phosphodiesters à l’intérieur d’une molécule d’acide nucléique. Coupent les liens d’un
seul brin ou des 2 brins. Non-spécifique (DNAse 1) ou spécifiques (enzymes de restriction).
Qu’est-ce que la restriction contrôlée par l’hôte?
Les bactéries peuvent digérer spécifiquement l’ADN phagique, en méthylène leur ADN pour se protéger de la digestion.
Quels sont les 2 types de palindrome?
Miroir et inversé
Quelles est l’utilité de former des dimères pour les enzymes de restriction?
Les enzymes de restriction reconnaissent une séquence d’ADN et coupent le duplex d’ADN sur les 2 brins à l’aide de
2 activités catalytiques
Qu’est-ce qu’un isoschizomère?
Enzymes ayant un même site de restriction avec une même spécificité
Qu’est-ce qu’un isoschizomère?
Enzymes ayant un même site de restriction avec une même spécificité
Qu’est-ce qu’un néoschizomère?
Enzymes ayant un même site de restriction avec une même spécificité mais générant des produits différents
Pouvons nous utiliser plusieurs enzymes de restriction en même temps?
Oui, mais cela dépend des conditions optimales de catalyse pour chaque enzyme. Les tampons des enzymes de restriction peuvent varier et inhiber les enzymes. Ainsi, selon les enzymes utilisées, on pourra digérer en même temps 2 sites de restrictions à l’aide de 2 enzymes distinctes, ou bien il faudra d’abord digérer avec 1 enzyme, purifier l’ADN
digéré pour enlever le tampon de réaction et l’enzyme pour ensuite digérer avec une autre enzyme !
Pouvons nous utiliser plusieurs enzymes de restriction en même temps?
Oui, mais cela dépend des conditions optimales de catalyse pour chaque enzyme. Les tampons des enzymes de restriction peuvent varier et inhiber les enzymes. Ainsi, selon les enzymes utilisées, on pourra digérer en même temps 2 sites de restrictions à l’aide de 2 enzymes distinctes, ou bien il faudra d’abord digérer avec 1 enzyme, purifier l’ADN
digéré pour enlever le tampon de réaction et l’enzyme pour ensuite digérer avec une autre enzyme !
Les endonucléases de type 2 ont besoin de quoi pour fonctionner?
Mg2+
Les enzymes fonctionne de manière optimale selon quoi?
La concentration de NaCl, Mg2+, le pH de 7,4 et la température de 37 degré Celcius et les conditions d’oxydoréduction
Qu’est-ce que l’activité star?
Lorsque de mauvaise conditions expérimentales modifie la spécificité des enzymes
Pourquoi le profil de digestion n’est pas simple lorsqu’on étudie la digestion des plasmides?
À cause du profil migratoire de différentes formes topologiques de l’ADN plasmide : L’ADN superenroulée migre plus rapidement sur gel, la digestion simple brin migre moins vite et la digestion double brin migre entre les 2
Comment la ligase peut-elle lier les fragments d’ADN?
Elle reforme les liens diester
Quelles sont les caractéristiques de la T4 DNA ligase?
o Il s’agit de la ligase la plus utilisée en laboratoire.
o A besoin d’ATP pour fonctionner (pas NAD+, comme d’autres)
o Peut effectuer la ligation d’extrémités franches et cohésives
o N’effectue pas la ligation des acides nucléiques sb
Quels sont les 2 ingrédients essentiels de l’ADN recombinant?
Enzyme de restriction et ligase
Qu’est-ce que la fidélité chez une polymérase?
Le fait qu’elle soit capable de corriger ses erreurs avec son activité exonucléase
Qu’est-ce que le fragment de Klenow?
Version tronquée de l’ADN pol 1 de E. Coli sans activité exonucléase
Qu’est-ce que la transcriptase inverse?
Polymérase à ADN qui est ARN-dépendante
La RT forme quoi?
De l’ADN complémentaire à partir d’ARN
Quelles sont les avantage de E. Coli?
• Temps de division cellulaire très court, d’environ 20 minutes
• Conditions de culture simples
• Culture non-dispendieuse
• Possibilité de production de masse (plasmides ou protéines)
Quelles sont les inconvénients de E. Coli?
• Ne sont pas naturellement compétentes à la transformation
• Aucune modification post-traductionnelle des protéines produites
• Difficulté à établir des ponts disulfures
• Certaines protéines produites sont insolubles et s’accumulent dans des corps d’inclusion
• Certaines effectuent de la recombinaison, ce qui peut modifier les plasmides
Qu’est-ce qu’une bactérie compétente?
Bactérie qui est capable d’intégrer le matériel génétique présent dans son environnement par un processus de transformation
Comment appelle-t-on les protéines qui forment un canal couplé à des nucléases dans la paroi bactérienne de la bactérie compétente?
Le complexe de compétence
Une bactérie peut être compétente dans quelle phase?
La phase exponentielle de croissance
Quelles sont les 2 techniques utilisées pour rendre des bactéries compétente (les expliquer)?
1- Techniques du CaCl2 et choc thermique : choc thermique augmente la perméabilité des membrane, du a une dépolarisation et une perte de lipides. 1 plasmides peut donc rentrer par des pores et intégrer la bactérie
2- Électroporation : bactéries sont placer dans une cuvette avec courant électrique lorsqu’on les mets dans un électroportatif. Elles vont donc subir des modifications de potentiel membranaire, ce qui augmente leur perméabilité
Qu’est-ce qu’on retrouve dans le milieu SOC?
- Peptones
- Extrait de levures
- NaCl
- Glucose
Dans la méthode de sélection par le criblage bleu-blanc, que signifie les colonies bleus et les colonies blanches?
- Lorsque le plasmide contient le gène de la beta-galactosidase, l’expression de cette dernière entraîne la modification enzymatique d’un substrat qui vire au bleu.
- Lorsqu’un gène est cloné dans le gène de la beta-galactosidase, celle-ci n’est plus exprimée, et donc les colonies sont blanches. Les colonies contenant les plasmides recombinants d’intérêt sont donc les colonies blanches.
Qu’est-ce qu’un opérons?
Un opéron est un ensemble de gènes tous induits ensemble chez les procaryotes
Quel sont les différents objectifs du clonage?
- Production de protéines dans les bactérie
- Sous-clonage
- Essais rapporteurs
- Invalidation ou silençage de gènes
- Production de la protéines dans des cellules de mammifères
- Transcription In Vitro
- Mutagénèse dirigée
D’où peut provenir l’ADN à cloner?
- ARN → ADNc
- Fragment d’ADN génomique soniqué ou digéré
- 2 ADNsb de synthèse, hybridés en ARNdb
- D’un autre plasmide (sous-clonage)
La tailles du plasmide peut-elle être illimité dans le clonage?
Non, la taille de l’insert est limitée selon le vecteur, car sinon il peut y avoir des problèmes de transformation bactérienne, de réplication et de stabilité du plasmide
Que permet la phosphatase alcaline lors du clonage?
Va enlever tous les 5’-PO4 du vecteur, l’empêchant d’être refermé sur lui-même sous l’action de la ligase.
Comment s’assurer que l’insert soit placé dans la bonne direction?
Le gène que l’ont veut exprimé à partir du plasmide doit être placé en aval d’un promoteur, dans le bon sens et doit respecter le cadre de lecture. Pour s’assurer que l’insert est dans la bonne direction, on utilise 2 enzyme de restriction distincte, en incluant au moins 1 enzyme qui génère des extrémité cohésive
Pour le design d’amorces antisens, que doit-on déterminer?
LE complément inverse de la séquence
Quels sont les éléments important d’un vecteur pour un clonage pour expression de protéines recombinante dans des bactéries?
- Système inductible à l’IPTG
- l’PTG permet de produire une proté.ine avec tag GST placé en N-terminal
- Fi ori qui permettra l’encapsidation du génome simple brins dans des phases
- TEV : site de clivage
- Lacl : encode pour le répresseur lac
Quel est le substrat de la protéine GST?
Glutathion
Quel est le TAG dans le clonage pour expression de protéine recombinantes ?
HA: Hémagglutine
Ou peut-on placer les TAG?
En N- ou en C- terminal
À Quand on veut sous-cloner un ADNc, a quoi sert l’ajout d’un épitop concentionnel?
Servent à détecter, isoler et purifier les protéines produites
Quel est le but d’avoir 2 vecteurs dans l’essai ’’ dual luciférase’’?
Inclut un vecteur de normalisation afin de diminuer les variations du gènes d’intérêt
