Oligonucléotides Flashcards
Qu’est-ce que des Oligonucléotides antisens?
Petit oligodésoxynucléotides simple brins de 12 à 24 ne
Quels sont les mécanismes d’action des Aso?
1- Dégradation spécifique d’un ARN
2- Blocage de la traduction d’un ARNm
3- Déstabilisation/stabilisation d’un ARN
4- Interférence avec l’épissage par masquage (ex: exon-skipping)
5- Ajout d’un exon (ex: trans-épissage)
Quels est le role de la RNase H?
Entraîne une dégradation de l’ARNm cible
Est-ce que la RNase est spécifique?
Non
La RNase H1 coupe l’ARN dans quelle condition?
Dans l’hétéroduplex ARN-ADN
Quels sont les 6 caractéristiques importante pour le développement d’ASO thérapeutique?
1- Leur stabilité
2- Leur capacité à lier des protéines plasmatique
3- Leur capacité à lier l’ARN complémentaire
4- Leur capacité à induire la dégradation d’une cible via la RNAse H1
5- Leur capacité à entrer dans la cellule
6- Leur absence d’induction de réponse immunitaire
Quels sont les caractéristiques des ASO de première génération?
+ stable (résiste nucléases)
Colle aux protéines (hydrophobe)
Moins éliminé par reins (colle protéines
Seraient + immunogène (et pro-inflamm.)
Quels sont les caractéristiques des ASO de 2e et 3e génération?
Plus rigides, duplex ARN-ASO plus stables
Ressemblent plus à de l’ADN (2’ pas désoxy)
et donc RNAse H pas efficace
= utilisés en combinaison avec PS ou pas pour dégradation
Quels sont les avantages des Oligonucléotides antisens
• Peuvent cibler directement l’expression d’une
protéine au rôle pathologique et agir ainsi à la source
du problème
• Peuvent moduler une cible pour laquelle il n’y a pas
de drogue (par ex: inhibiteur d’enzyme)
• Grande polyvalence, plusieurs d’utilisations possibles
outre la réduction de l’expression des gènes
(épissage, augmentation de l’expression, modulation
de protéines en tant que ligands (aptamères), etc.)
• Bonne libération et action au foie (à cause de la
formulation en nanoparticules lipidiques)
• On peut en théorie cibler un organe en couplant la
formulation à un ligand (anticorps ou aptamère), par
exemple sur une nanoparticule contenant des ASOs.
• Les modifications chimiques peuvent augmenter la
demi-vie et minimiser l’immunogénicité
Quels sont les inconvénients des Oligonucléotides antisens?
• Spécificité peut être difficile à atteinte
• Ne traversent pas la barrière hémato-encéphalique
• Nécessité de voies de livraison invasives
(intraveineuse, sous-cutanée, intrathécale)
• Organes autres que le foie sont difficiles à cibler sans
ajout de ligand, et même avec usage d’une
formulation il peut être difficile de cibler des tumeurs
solides.
• Nécessite des traitements continus (fréquents) et
dispendieux
• Effets non-spécifiques potentiels: il est important de
suivre les recommandations du OSWG (The
Oligonucleotide Safety Working Group).
• Toxicité due à la séquence, les modifications
chimiques, la compétition avec des processus
naturels de régulation des ARNs… Toujours un certain
risqué…
Quels sont les 2 activité essentielles du pathway ARNi?
- Reconnaissance d’un ARNm cible
- Destruction de cet ARNm cible
Que peut donner un précurseur de miRNA?
- 2 miRNA en proportions égales ou en proportions inconnues
- 2 miRNA en proportions inégales
Quels sont les étapes de biogénèse des miRNA?
1) Synthèse du microARN primaire (pri-miRNA):
transcription via ARNpolII/III dans le noyau
2) Maturation du pri-miRNA en microARN précurseur
(pre-miRNA): par le complexe du microprocesseur, formé de Drosha et de DGCR8(Pasha)
3) Export: via exportin-5, Ran, GTP
4) Maturation en duplex: par Dicer et la protéine de liaison à l’ ARNdb TRBP. Dicer laisse des extensions de 2 nt en 3’
5) Le brin fonctionnel (guide) est chargé avec Ago2 sur le complexe RISC, alors que le brin passager est détruit. Ago2 reconnait les extensions 3’ du brin guide (domaine PAZ) et ouvre le duplex avec le domaine N.
6) Activité ‘’slicer’’ des argonautes (Ago2) clive la cible (ARNm) avec activité ribonucléase.
Qu’est-ce qui représente la séquence SEED?
Les nt 2-8 en 5’ du brin antisens (guide) au sein du complexe RISC
Quelles séquence interagit avec les séquences complémentaires dans les 3’-UTR des ARNm?
La séquence SEED
Qu’arrive-t-il s’il y a une complémentarité parfaite entre toute la séquence du guide et de la cible (pas juste la séquence SEED?
L’activité slicer de RISC est sollicitée et il y a dégradation du transcrit.
Quels sont les différences entre les petits ARN interférents et les microARN?
- Petit ARNs interférents : produit par diver à partir d’ARNdb viraux ou transfectés directement, complémentarité parfaite, cible spécifique, dégradation rapide
- Micro ARNs : produit naturellement, complémentarité partielle, plusieurs cibles, bloque la traduction et dégradation plus lente
Quels sont les méthodes de bases qui permettent facilement d’utiliser la machinerie de l’ARNi à des fins expérimentales?
1- Petits ARNs interférents : miment un miRNA mature
2- Les ARN en petites boucles : ils miment un pré-miRNA en boucle
Quels sont les obstacles importants de l’ARN interférence?
Stabilité ou toxicité
Comment les ARNi peuvent-ils être toxiques?
1) L’ARNdb peut être reconnu par des senseurs de l’immunité innée
2) Les excipients (nanoparticules) peuvent se décomposer et causer de la toxicité et des réactions immunologiques liés à l’infusion intraveineuse.
3) Activité ‘’off-target’’ ou hors-cible. La séquence seed peut avoir un grand nombre de cibles
4) Activité dans des organes non ciblés.
Quels sont des exemples de modifications permettant d’améliorer le potentiel thérapeutique des siRNA?
- Phosphorothioate (PS): résistance aux nucléases, augmente la liaison aux protéines plasmatiques (albumine), ce qui
augmente leur demi-vie plasmatique et leur entrée cellulaire. Il faut bien doser le nombre de résidus modifiés. - 2’-OMe/2’-O-MOE: augmentent la stabilité en bloquant le groupe 2’OH nucléophile. Augmente l’affinité pour l’ARNm. Réduit
l’immunogénicité dans le corps.
-Bases modifiées: peut diminuer la reconnaissance par des senseurs de l’immunité innée et augmenter la stabilité.
Quelle enzyme retire la queue polyA de l’ARNm?
CCR4-NOT
Quel enzyme a comme rôle la dégradation de l’ARNm en 3’ 5’?
Exosome
Quelles sont les enzymes qui permettent d’éliminer le cap?
- Dcp1/2 (exoribonucléase
- Hedls (échafaudage)
Les cellules myélomateuse utilisé pour la fusion perdent la faculté de produire quelle enzyme?
Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT)
L’enzyme HGPRT est impliqué dans quoi?
La synthèse de nucléotides, particulièrement dans la voie de sauvetage
