protein purification Flashcards
methodes pour détruire les cellules?
- congélation/décongélation
- écrasement mécanique
- pression/dépression brutale
- détergents
- ultrasons
*lyzozyme qui détruit les mb
calculation of Absorbance of AA (Beer-Lambert law)
A = epsi * L * C
methods to emasure protein concentration
- Bradford assay with Coomassie blue
- BCA assay (bicinchoninic acid)
Bradford assay
Mechanism: In an acidic environment, three forces contribute to binding between Coomassie and the protein:
* ionic interactions between the sulfonic groups of Coomassie and the basic residues (lysine, histidine, and arginine) of the protein * van der Waals forces between the aromatic residues (tyrosine, phenylalanine, and tryptophan) of the protein and Coomassie * hydrophobic forces
Binding to protein causes a spectral shift in the absorbance of Coomassie from a maximum at 465nm (red/brown in color) to a maximum at 595 nm(blue/purple in color
BCA assay
Cu2+ + protein -> cu1+ + oxidized protein
cu1+ + BCA -> BCA-cuivre complex, absorbance at 562 nm
purification methods for protein
- ammonium sulfate precipitation
- ion exchange chromatography
- size exclusion chromatography (gel filtration column)
- affinity gel chromatography
1 unité d’activité enzymatique U =
quantité d’enzyme qui produit 1 µM de produit en 1 minute
dans des conditions données ex: 70°C, pH = 7
Electrophorèse
séparation basé sur la charge
force dans un champ electrique =
Z (charge) * E (champ électrique)
vitesse d’une protéine dans un champ
Z*E / f
f = friction
défauts de native gel electrophorèse
- Friction dépend de la forme de la protéine
- Les protéines se déplacent dans 2 directions
rôle et formule de SDS
*sodium dodecyl sulfate CH3 (CH2)11 O SO3
* déplie les protéines en se fixant à la protéine
quels agents reducteurs et quel role?
- Beta ME et DTT (dithiotreitol)
- Réduction des liaisons covalentes S-S avant SDS-Page
formule acrylamide
CH2=CH-CONH2
quelles réactions permettent de former du polyacrylamide
- radical polymérisation avec persulfate
- crosslink des chaînes avec Bis-acrylamide
quels colorants dans un gel de polyacrylamide pour visualiser les protéines?
- Bleu de coomassie -> 100ng
- Réaction argentique -> 20ng
- coloration Zn
comment évolue la mobilité des protéines en gel selon la masse des protéines?
Rf = -alpha*log(Mw)
Rf = mobilité, Mw= molecular weight
Méthodes de séparation des protéines par électrophorèse
- Electrophorèse sur gel non dénaturant
- polyacrylamide gel electrophorosis SDS-PAGE
- isoélectric focusing electrophoresis (IEF)
- 2 dimensional gel electrophoresis
3 choses importantes sur IEF
- Le gel comporte un gradient de pH, et des électrodes à chaque extrêmité
- La migration dépend du pH isolectrique de la protéine (pI)
- C’est une méthode à haute résolution
Principe de 2D GE
- IEF normale
- utiliser le gel IEF en entrée de SDS-PAGE
quel procédé permet de visualiser le front de migration de SDS-PAGE?
Bromophénol (bleu) est ajouté au fond du puit, créant un front de migration bleu
quelle vitesse de centrifugation concentre les noyaux dans le culot?
800g
quelle vitesse de centrifugation concentre les mitochondries dans le culot?
10 000g
quelle vitesse de centrifugation concentre les microsomes (ribsomes et mb) dans le culot?
100 000 g pendant 2h
