peptide sequencing Flashcards
Identify the different levels of protein structure.
- Primary structure = AA sequence + disulfide bonds
- secondary structure = alpha helix and beta strands
- tertiary structure = global fold of protein or major components(= domains)
- quaternary structure = relationhips of chains to each other (if > 1 chain)
2 méthodes pour séquencer des protéines?
- Edman degradation
- MS/MS
Edman degradation steps
- peptide c-terminus fixed on filter
- add phenyl isothiocyanate PITC in basic condition
==> phenylthiourea derivative of the peptide - add trifluoroacetic acid (TFA) to catalyze amid bond break
==> free N terminus analino thiazolinone dérivative of AA - add acid (= organic extraction)
==> phenylthiohydydantoin derivative of AA = PTH-AA - run the product on a column to determine the PTH-AA
limites de la réaction d’edman?
rendement = 97%
==> Possibilité de séquencer maximum 50 AA
comment séquencer avec Edman de Protéines de > 50 AA?
En utilisant des protéases (trypsine et chemotrypsine) pour réduire la taille des fragments.
où clive la trypsine?
Après arginine et lysine
où clive la chymotrypsine?
après les AA aromatiques: tryptophane, tyrosine, phénylalanine
que signifie maldi-tof?
Matrix Assisted Laser Desorption ionization-Time of Flight
Principe de MALDI-TOF?
- les protéines fragmentées sont fixées sur une matrice
- Un laser les ionise (ionisat!ion douce) positivement
- Un champ électrique les accélère
- Dans une chambre vide leur vitesse est inversement proportionnelement à leur masse
- On mesure le temps pour arriver au détecteur
relation entre le champ électrique et la vitesse?
F = qE = ma
==> a = qE/m
a = accélération dont dépend la vitesse finalle
Condition pour utiliser le fingerprint d’une protéine en MALDI-TOF?
Il faut qu’elle soit déjà répertoriée dans une base de données
principe du séquençage MS/MS?
- MALDI-TOF pour séparer les protéines
- En sortie, la protéine d’intérêt subit une ionization forte (hard ionization) qui détruit les liaisons amides
- Décomposition du peptide en Y-ions qui sont détectées par mass spectrometry
- chaque AA est déduit de la diff de masse entre 2 Y-ions
les ions non Y-ions sont ignorés (mais ils existent)
Structure des Y-ions?
peptide avec extrêmité C terminale intacte et extrêmité N-terminale clivée
