protein Flashcards
Protein A (Mw 100 000 g/mol, IP 5,8; B 98 000g/mol, IP 8,3 och C (Mw 25000 g/mol och IP 6,8 skall separeras från varandra med kolonnkromatografi. .Du inser att det finns ingen kromatografimetod där du kan göra detta i ett enda steg utan måste för att få alla tre separerade nyttja 2 kromatografier. Du finner vidare att du bör börja med gelfiltrering på Sephadex G 150 (proteiner <150 000 går in i porerna) och sedan på del av erhållet eluat även köra en jonbyteskromatografi på en anjonbytare .
a. Ge exempel på buffert (inkl pH) som gelfiltreringskolonnen bör vara ekvilibrerad med? (2p)
Svar: Här skall vi tänka ett steg längre – vilket pH och buffert bör jag ha för att det skall fastna på min jonbytare i nästa steg.
Vi kan även se att A och B har ungefär samma molvikt och kommer alltså ut samtidigt från gelfiltreringskolonnen medan C kommer senare och kan separeras från de andra. De som alltså skall separeras på jonbytaren är bara A och B och det är ju möjligt eftersom de skiljer åt i IP. Hade de haft samma hade inte det varit möjligt.
a. Du får beskedet att du skall nyttja en anjonbytare, alltså skall dina proteiner ha – laddning för att fastna. pH i bufferten måste vara högre än pKa värdet. Det högst pKa värdet har B med 8,3 och det är det som måste avgöra. Så buffetten bör ha pH 8,3 + ca 1,5= ca 9,8. En möjlig buffert är ex en Tris-HCl buffert eller en glycin-NaOH som har buffertkapacitet i detta basiska område. Så förslaget blir 0,1M glycin-NaOH buffert pH 9,8.
