fråga3 Flashcards
- I ett tidigt steg vid upprening av ett protein från biologisk vävnad nyttjas
Redogör för hur dessa uppreningssteg utförs. (4p)
a. Fraktionerad centrifugering.
b. Reversibel saltutfällning
Svar: Man tillsätter successivt salt – vanligen NH4SO4 – och proteiner faller undan för undan beroende på hur hög grad av hydrofobicitet de uppvisar. Ju mer hydrofoba desto snabbare faller de eftersom hydrofoba interaktioner mellan proteinmolekylerna förstärks (de aggregerar och bildar olösliga aggregat således) om den omgivande lösningens jonstryka höjs. När ett protein har fallit ut (aggregerat) centrifugeras det ner och fås i pelleten. Till supernatanten kan ytterligare salt sättas och då faller kanske ett nytt protein ut, osv. Det är därför saltutfällning är en separationsmetod för olika proteiner faller vid olika salthalter. Men ett viktigt steg är alltså mellanliggande centrifugeringar och successivt borttagande av de protein som fallit.
Att den är reversibel betyder att proteinet går i lösning igen om vatten tillsätts till pelleten – proteinet har inte tagit skada av utfällningen utan återfås i nativ konformation.
a.
Svar: Man kör först en centrifugering vid lågt g tal och rel kort tid, ex 1000 g i 10 minuter och får då ner stora partiklar,
celler, etc. i pelleten.
Sedan tar man supernatanten och centrifugerar den men nu vid högre g-tal och ev längre tid – får ny supernatant och pellet och går vidare med supernatanten och centrifugerar på nytt vid ännu högre g-tal och längre tid, osv.
b.
